A tecnologia atual permite o uso de anticorpos criados na mesma espécie para detectar até sete marcadores. Demonstrando o procedimento estará Loucia Chan, uma técnica do laboratório. Comece preparando as lâminas de vidro embutidas de parafina fixas formalina montadas com a amostra de tecido, colocando os slides planas em um forno, para assar a 60 graus celsius com o tecido voltado para cima.
Após uma hora, depila e reidratar os slides por 10 minutos cada um com a série de produtos químicos, como descrito no manuscrito. Submergir os slides em soro fisiológico tris-tampão, e depois em uma caixa de slides de plástico preenchido com uma mistura de formaldeído diluído em metanol, para corrigir as amostras. Em seguida, lave os slides duas vezes em água desionizada por dois minutos.
Prossiga para a recuperação de epítope, colocando o rack de slides em uma caixa de resistência ao calor preenchida com tampão de ácido cítrico no pH 6.0. E, em seguida, colocar a caixa no micro-ondas, para aquecer os slides primeiro em 100% de potência por 50 segundos, seguido por 20 minutos com 20% de potência, para manter a mesma temperatura. Depois de enxaguar os slides em água destilada e lavar com TBST, mergulhe o slide em um frasco contendo uma solução de bloqueio de peroxidação por 10 minutos.
Após a incubação, enxágue os slides em água destilada e lave com TBST, em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para marcar um limite em torno da seção tecidual na lâmina. Em seguida, enxágue o slide em TBST, cubra as seções teciduais com o tampão de bloqueio e incuba as lâminas em uma câmara umidificada por 15 minutos. Para remover os reagentes de bloqueio, primeiro incubar os slides com o anticorpo primário de interesse e, em seguida, remover o anticorpo primário lavando os slides três vezes com TBST, antes da incubação com o polímero rabanete peroxidase rotulado, anticorpo secundário.
Após a incubação, lave os slides antes de aplicar a flora opala para a solução de trabalho TSA e enxágue o slide com o tampão de recuperação de antígeno. Realize a desmontagem à base de micro-ondas aquecendo os slides em tampão de recuperação de antígeno em um micro-ondas a 100% de potência, por 50 segundos, seguido por 20% de potência por 20 minutos nos recipientes seguros de micro-ondas. Depois de resfriar as amostras em temperatura ambiente por 15 minutos, enxágue os slides em água destilada e TBST e depois incubar com solução dappy por cinco minutos.
Em seguida, seque o slide antes de montar com o meio de montagem apropriado. Antes de a imagem dos slides predefinir os filtros apropriados na estação de trabalho. Capture um mínimo de 10 campos para análise sob 200 vezes a ampliação.
Para contar as células, clique no botão objetos de contagem na barra de passo, para exibir o painel de configurações de contagem de objetos. Se o tecido tiver sido segmentado, selecione a categoria de tecido em que os objetos devem ser encontrados. Em seguida, selecione o dimensionamento de sinal desejado a partir de escala automática ou escala fixa.
Para segmentação de objetos, selecione o componente principal da lista de retirada. Para detectar objetos tocando outros objetos como objetos individuais e não combinados, verifique o tamanho máximo e a caixa de pixels e, em seguida, opte pela divisão refinada. Em seguida, conte todas as células estromas nas células imunes separadamente, para expressar os dados como as porcentagens das células imunes em relação ao número total de células estromas para cada imagem capturada.
Mais tarde, informe a contagem final de células como uma média de todos os campos. Usando o editor de exibição, examine as tabelas de dados resultantes após o processamento e exporte a tabela de dados da contagem. Na análise representativa, quatro tipos de células imunes na amostra de endométrio somos diferenciados.
A imagem processada mostra a segmentação tecidual como epitelial e compartimentos estrogonais. A imunosstaining multiplex foi realizada nas biópsias endometrial de uma mulher de controle fértil e uma mulher com aborto recorrente inexplicável, piso único para nós representando CD3, CD56, CD68 e CD20 foram revelados na imunostaining. Uma vez identificado o som imunológico, novas manchas sob a citocina podem ajudar a lidar com sua interação e mecanismo para o sucesso da implantação.
