Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области биоматериалов. Особенно для регенерации костей. Они используются для оценки эффективности биоматериалов и потенциальных иммунных реакций.
Основным преимуществом этой многопрофильной платформы является то, что она обеспечивает ряд параметров для прогнозирования биосовместимости биоматериалов, используемых для восстановления костей. Последствия этих методов in vitro и in vivo кости распространяются на другие заболевания костей. В связи с необходимостью доклинического скрининга новых ортопедических биоматериалов.
Дерматологическая методология может дать представление о биоматериалах для заживления костей, она также может быть применена к оценке биоматериала для любых других клинических показаний. Аспират культуры среды от первичных остеобластов 14 дней после добавления остеогенной среды минерализации. Промыть дважды с 0,5 миллилитров 1X PBS.
Затем исправить клетки, добавив 0,5 миллилитров 10%buffered формалин раствора и инкубации при комнатной температуре в течение 10 минут. Через 10 минут, аспирировать 10%buffered формалин с одноразовым пипеткой и мыть дважды с 0,5 миллилитров ультрачистой воды. Затем добавьте 250 микролитров 40 миллимоляров Alizarin Red S окрашивания раствора для фиксированных остеобластов.
И инкубировать пластину при комнатной температуре в течение 10 минут на шейкере при температуре 100 коктейлей в минуту. После инкубации раствором окрашивания, аспирировать окрашивание раствор с одноразовым пипеткой и промыть одним миллилитром ультрачистой воды. Повторите этот шаг пять-десять раз, пока полоскания решение приходит ясно, чтобы удалить неспецифические окрашивания.
После аспирации окончательной стирки, добавить один миллилитр холодного PBS. И инкубировать тарелку при комнатной температуре в течение 10 минут на шейкере, как и раньше. Затем перенесите окрашенные бета-фосфатные диски трикальция в новую колодец и сканируйте пластины с помощью планшетного сканера для записи минерализации.
После захвата изображения добавьте 250 микролитров раствора хлорида 10%цетилпиридин и встряхните в течение 15 минут, чтобы извлечь краситель Alizarin Red S. Затем перенесите раствор из скважин в отдельные трубы и центрифугы на 17 000 х г в течение пяти минут при комнатной температуре. Разбавить экстракт раствором хлорида 10%цетилпиридиния при разбавлении рациона от 1:10 до 1:20 в 1,5 миллилитровой трубке.
Затем перенесите 300 микролитров каждого разбавленного образца в скважины пластины из 96 скважин. Включите две пустые скважины, содержащие только 10%cetylpyridinium хлорид. Далее, подготовить семь Alizarin Red S эталонных стандартов, начиная от 4 400 микромоляра путем разбавления 40 миллиомолярных Alizarin Red S окрашивания раствор с 10%cetylpyridinium хлорид решение для создания стандартной кривой.
Загрузите в тарелку 300 микролитров каждого стандарта. Наконец, прочитайте абсорбенты образцов, заготовок и эталонных стандартов на 520 нанометров. Изолировать прекурсоры остеопласта костного мозга от бедренной кости и голени усыпляемой мыши с помощью стерильных ножниц для удаления ног из тела в тазобедренном суставе.
Отрежьте конечности в коленных и голеностопных суставах и удалите мягкие ткани стерильным скальпелем и миппами. Отрежьте эпифизики. Вставьте 27 калибровочных игл, прикрепленных к шприцу заполнены одним миллилитром среды роста костей в люмен и промыть костный мозг в шесть сантиметров стерильной чашки Петри.
Повторив это для всех бедренной кости и голени, перенесите подвесную клетку в 50 миллилитровую коническую трубку. Вымойте шестиметровую чашку Петри пятью миллилитров среды роста костей и перенесите ее в ту же 50-миллилитровую коническую трубку. Центрифуга при 350 x g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут.
После центрифугации повторно приостановить клетки в один миллилитр на колодец остеокласт дифференциации среды. Одна мышь BALB/c обеспечивает достаточное количество прекурсоров остеокласта для одной пластины культуры 24-колодец. Добавьте первичные остеобласты, подвешенные в среде роста костей, на биоматериал и элементы управления на уровне 8,8-10-4 клеток на квадратный сантиметр.
Здесь используются бета-фосфатные диски трикалция, контролируемая кость крупного рогатого скота и пластик культуры тканей. Инкубация при 37 градусах по Цельсию в пяти процентах углекислого газа в течение 24 часов. Через 24 часа добавьте свежеиспеченные прекурсоры остеокласта костного мозга и среду дифференциации остеокласта к культурным первичным остеобластам и вернитесь в инкубатор на пять дней культуры при 37 градусах по Цельсию при пяти процентах углекислого газа.
Замените среду свежеприготовленной дифференциацией остеокласта через день. Затем пятно остеокластов для тартарат устойчивых кислот фосфатазы для оценки дифференциации. Бритье кожи головы обезболивающей восьминедельной мыши BALB/c и очистить поверхность с 7,5%povidone йодный раствор и 70% этанола.
Обложка глаза с офтальмологической мази, чтобы предотвратить высыхание во время процедуры. Обеспечить соответствующий уровень анестезии при отсутствии реакции на ногой и хвостом щепотку. Затем после принятия средней линии sagittal разрез удалить паракраний соединительной ткани выше правой теменной кости, соскоб его скальпелем.
Затем используйте стерильный зубной трефин диаметром четыре миллиметра при 2000 вращениях в минуту, чтобы создать дефект критического размера в правой теменной кости. Постоянно орошать область стерильным солевым раствором, зазубрин правой теменной кости и резки через эктокортекст и некоторые эндокорты. Чтобы предотвратить повреждение Dera Mater, используйте небольшой периостейный лифт, чтобы прорваться через оставшийся эндокортекс.
Затем используйте типсы, чтобы тщательно поднять кальварную кость и удалить ее. Полученный дефект должен быть круглым и примерно 3,5 миллиметра в диаметре. Затем заполните дефект голгофы бета-трикальцием фосфатной коллагеновой пены, предварительно засовываемой в стерильный PBS.
Чтобы сохранить биоматериал на месте, нанесите 0,5 микролитров клея ткани в конце дефекта в двух противоположных точках. Затем закройте кожу неабсорбируемым швом. Поместите анестезированным мышонок на спину, побрите мех брюшной полости и очистите бритую поверхность раствором йода 7,5%povidone и 70% этанола.
После принятия восьмимиллиметрового разреза средней линии через кожу вдоль линии альба живота, имплантат PBS пропитанной биоматериала под кожей. Затем шов кожи с неабсорбируемым швом. Восемь недель после имплантации, акциз места имплантации с окружающими тканями от усыпанной мыши.
Это изображение показывает, что рост на бета-трикалция фосфатных дисков показано в открытых барах не влияет на остеобласт жизнеспособности по сравнению с ростом на ткани культуры пластика в семь и 14 дней культуры. Культурные остеобласты были окрашены Alizarin Red S после 14 дней. Минерализация была выше для минерализации среднего контроля по сравнению с остеобластов, культурных в среде в одиночку.
А на бета-трикальциях фосфатные диски в подвеске культуры колодцев. Когда хирургически-индуцированных критических размеров кальвариального дефекта остался пустым, тонкий слой, охватывающий весь дефект наблюдался, но не значительное образование костей присутствовал на 12 недель после операции. В отличие от этого, когда дефект содержал бета-трикалция фосфатной коллагеновой пены, остатки пены, окруженные плотной волокнистой ткани, включая некоторые кровеносные сосуды и воспалительные клетки моста дефект области без доказательств формирования костей.
После подкожной бета-трикальция фосфатной коллагеновой пены имплантации, воспалительные реакции с инодерным телом гигантских клеток наблюдалось на гематоксилин и Эозин окрашенных разделов доказательства фиброза на трихроме окрашенных секций Массона в восемь недель. В отличие от этого, место имплантации фиктивных элементов управления имело минимальное воспаление и отсутствие фиброза. При попытке этой процедуры важно сделать точный и воспроизводимый зазубрин кальвари, не причиняя вреда животному.
После этой процедуры другие методы, такие как остеокласт дифференциации анализов и высокой пропускной способности в брюшной иммунной модели могут быть заранее для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, как остеокласт в ответ на биоматериалы и тип иммунного ответа.
