Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся генетической регуляции формирования и поддержания гемового барьера на нескольких стадиях развития дрозофилы. Этот метод также может быть адаптирован для изучения проницаемости других барьеров, таких как кишечный эпителий в различных организмах. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет оценку функции гемового барьера в живых тканях.
Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как манипуляции с образцами могут быть трудными, а многие шаги требуют пристального внимания к деталям. Для сбора эмбрионов место как минимум 50 девственных женщин с 20 до 25 мужчин на бутылку с кукурузной муки Агар пищи и инкубировать эти мухи в течение одного-двух дней до начала коллекции. За день до сбора, теплый яблочный сок агар тарелки при 25 градусов по Цельсию на ночь.
На следующее утро перенесите углекислый газ анестезированные мухи в коллекционные клетки и поместите предварительно разогретую агарную тарелку яблочного сока с небольшим мазком дрожжевой пасты на открытом конце клетки. Затем закретив тарелку в клетку красным рукавом. Чтобы очистить старые эмбрионы, позвольте мухам откладывать яйца на тарелку яблочного сока агара в течение одного часа при 25 градусах по Цельсию.
В конце инкубации, инвертировать клетку сетки стороной вниз и нажмите мух на дно клетки. Замените агар яблочного сока новой предварительно разогретой тарелкой яблочного сока с небольшим мазком дрожжевой пасты. Дайте мухам отложить яйца на новую тарелку еще на час при 25 градусах по Цельсию.
Чтобы собрать поздние эмбрионы 17-й стадии для инъекций, замените агаровую тарелку яблочного сока новой предварительно разогретой пластиной с мазком дрожжевой пасты. И позволить мухам откладывать яйца на тарелку при 25 градусах по Цельсию. После одного часа, заменить пластину и возраст пластины с собранными эмбрионами в течение 19 часов при 25 градусах по Цельсию, так что эмбрионы будут от 20 до 21 часов на момент визуализации.
В конце 19-часовой инкубации снимите пластину сбора эмбрионов с инкубатора и накройте поверхность пластины PbTx. Используйте кисть, чтобы ослабить эмбрионы с поверхности пластины в 70-метровый нейлоновый сетчатый ситечко. И поместите ситечко с эмбрионами в 50%bleach раствор в 100-миллиметровую чашку Петри в течение пяти минут с случайным возбуждением при комнатной температуре, чтобы дехорионировать их.
В конце инкубации, промыть эмбрионы три раза, закрученного ситечко в свежем PbTx, используя новую чашку Петри для каждой стирки. Вымойте эмбрионы в одну сторону ситечко с PbTx и использовать стеклянную пипетку для передачи эмбрионов на 2%agarose гель плиты. Удалите излишки жидкости с помощью фильтровальной бумаги.
Выровнять шесть-восемь эмбрионов на плите с задней справа и спинной стороны вверх и твердо нажмите кусок двусторонний ленты, прикрепленной к слайду на верхней части эмбрионов. Затем высасывание эмбрионов при комнатной температуре в течение примерно 25 минут, прежде чем покрыть образцы галоуглеродным маслом. Для сбора личинок, создать крест с 5 до 10 девственных самок мух желаемого генотипа и в два раза больше мужчин желаемого генотипа во флаконе с Cornmeal Агар пищи.
После пяти-семи дней при 25 градусах по Цельсию, в зависимости от генотипа, используйте типсы, чтобы аккуратно собрать блуждающие личинки третьей звезды из флакона и промыть личинки PBS, чтобы удалить любую застрявшую пищу. Передача личинок в яблочный сок агар пластины для генотипирования по мере необходимости, прежде чем использовать кисть, чтобы высушить личинки на ткани. Затем используйте миппы для переноса шести-восьми личинок на слайд, приготовленный с помощью двойной ленты.
Перед инъекцией используйте шкив micropipette для того чтобы вытянуть капиллярные пробки в стандартную форму иглы для впрысков D.Melanogaster и закрепить иглы в глине в чашке Petri. Для инъекций эмбриона используйте наконечник трубчатого геля с 20 микролитерами для загрузки подготовленной иглы с 5 микролитров 10 килодальтонного декстрана, конъюгированных для сульфододамина 101 хлорида кислоты, и загрузите иглу в держатель иглы. Распоимить иглу в микроманипуляторе, закрепленном на стальной основе, и установить инъекционный аппарат до 50 фунтов на квадратный дюйм и от 5 до 10 миллисекунд с диапазоном от 10.
Поместите слайд на стадии микроманипулятора и кисть края иглы против края двусторонний ленты под углом 45 градусов, чтобы создать слегка угловой кончик сломанной достаточно, чтобы поток 10 килодальтон dextran через отверстие. Насос педаль ноги, пока краситель находится на кончике иглы. Выровняй иглу так, чтобы она была параллельно эмбриону и проколола задний конец образца.
Насос педаль ноги, чтобы ввести два нанолитров красителя в образец. Обратите внимание на время инъекций для инкубации целей и продолжить вниз слайд для введения дополнительных образцов. Для инъекций личинок сделайте немного больше углового отверстия, чем то, что используется для инъекций эмбрионов, и угол иглы немного вниз к образцу, прежде чем вводить личинки с 220 нанолитров похож на как попродемонстрировано для эмбриональных образцов.
В конце 10-минутной инкубации инъекций используйте хлопчатобумажный аппликатор для применения вазелина на правой и левой сторонах образцов на слайде в качестве промека. Поместите крышку скольжения на вершине и поместите слайд на конфокальный микроскоп этапе. Выберите цель 20X и изображения образцов по всей глубине каждого эмбриона.
Затем вычислите процент образцов с скомпрометированным гемово-мозговых барьеров в соответствии с формулой. Перед началом процедуры вскрытия используйте лак для ногтей, чтобы смонтировать два крышки скольжения, размеченные примерно на 0,5 сантиметра друг от друга на слайде, и поместите впрыскиваемую личинку в PBS на слайде в конце 30-минутной инкубации. Используя одну пару типсов, схватить личинку на полпути вниз личинки тела и использовать вторую пару типсов, чтобы отделить передние и задние половинки личинки.
Далее используйте одну пару типсов, чтобы схватить переднюю область на крючках рта и использовать вторую пару типсов, чтобы инвертировать стенку тела над кончиком первой пары типсов. Мозг и брюшной нервный шнур будут подвергаться воздействию. Отделить мозг и брюшной нервный шнур от стенки тела, отделив нервы, если это необходимо, и удалить стенку тела со слайда.
Обложка образца с 10 микролитров 80%глицерол. Затем поместите крышку скольжения на верхней части образца для изображения и изображения образцов, чтобы определить процент образцов с скомпрометированным геммоуф мозговых барьеров, как попродемонстрировано. Когда дикий тип поздней стадии 17 эмбрионов вводят с 10 килодальтон декстран конъюгированных сульфородамин 101 кислотный хлорид флуоресцентный краситель, большая молекула декстрана исключается из брюшного нерва шнура, как и ожидалось.
Гетерозиготные сырые 1 мутантные эмбрионы обладают нетронутым геммозным барьером, аналогичным тому, который наблюдается у эмбрионов контроля дикого типа. В отличие от этого, гомозиготные сырые 1 мутант эмбрионов проявляют дефекты в целостности геммозефалический барьер, с 10 килодальтон декстран наводнения в брюшной нервный шнур, что свидетельствует о неспособности гемового барьера в форме. В образцах личинок дикого типа 10 килодальтонный декстран не проникает в гемово-мозговой барьер и исключается из мозга и брюшного нерва.
При попытке этой процедуры, правильное старение эмбрионов имеет решающее значение для обеспечения образцов рассматриваются в возрасте, в котором гемовно-мозговой барьер формирования, как ожидается, будет завершена. После этой процедуры мутанты, демонстрировали скомпрометированный гемово-мозговой барьер, можно продолжить с помощью генетики, иммуногистохимии и микроскопии, чтобы лучше понять функцию генов на клеточном уровне. Этот метод позволит исследователям определить дополнительные гены, которые имеют решающее значение для создания и поддержания гем blood-brain barrier.
