Этот протокол предусматривает простой метод фиксаторной перфузии у мышей, который позволит провести гистологическое исследование тканей ЦНС без значительных вложений. Основным преимуществом метода гравитационной перфузии, представленного здесь, является то, что обильное устройство может быть построено из легкодоступных компонентов. Продемонстрировать процедуру будет Арнав Рана, аспирант MD-PhD из лаборатории доктора Синь Цзе Чена.
Для начала, используя острое лезвие бритвы, обрежьте внутренние соломинки от двух 500-миллилитровых бутылок для мойки, разрезав их заподлицо с внутренней стороны винта на крышке. Вырежьте квадратное отверстие размером четыре на четыре сантиметра в нижней части каждой буферной бутылки, затем вырежьте еще одно небольшое отверстие на дне каждой бутылки, чтобы обеспечить прохождение изогнутого микропатка из нержавеющей стали. Затем создайте S-образный изгиб в шпателях микросов, чтобы их можно было использовать в качестве крючков для подвешивания буферных бутылок.
Вставьте изогнутые микро-шпатели в соответствующие отверстия в буферных бутылках. Затем плотно соедините две трубки длиной 25 сантиметров с наружными выходами из соломы бутылки и соедините концы этих трубок вместе с разъемом Y, затем присоедините трубку длиной 2 метра к свободному концу разъема Y. После извлечения плунжера из 1-миллилитра шприца отрежьте шприц примерно на 6 сантиметров от наконечника, сначала забив пластик лезвием бритвы, а затем резко щелкнув пластиком шприца.
Вставьте разрезанную поверхность шприца в свободный конец пластиковой трубки на достаточную глубину и обеспечьте плотное уплотнение. Затем пометьте одну буферную бутылку как PFA, а другую как PBS. Измерьте приблизительно 1/3 длины от отверстия бутылки и проведите линию вокруг окружности бутылки в этой точке, чтобы обозначить соответствующий уровень наполнения растворов перфусата.
После выпрямления большой скрепки создайте петлю, которая может поместиться по окружности трубки и поместите эту петлю вокруг трубки, непосредственно рядом со шприцем, затем поместите блок из пенополистирола соответствующего размера в стеклянный лоток, поместите концы скрепки в блок из пенополистирола, чтобы прикрепить трубку и используя бумажное полотенце, поднять передний конец стеклянного лотка примерно на 2 сантиметра. После промывки 1-литрового стакана дистиллированной водой, заполните его примерно 800 миллилитрами 18 миллиом воды молекулярно-биологического класса. Нагрейте стакан в микроволновой печи в течение трех минут или до тех пор, пока температура воды не достигнет 65 градусов цельсия, затем поместите его на нагревательную или перемешивающую пластину, хранящуюся в вытяжном шкафу.
Далее промыть перемешивающий стержень дистиллированной водой и поместить его в стакан. Запустите мешалку и переверните горячую плиту до среднего тепла, следя за тем, чтобы температура воды не поднималась выше 70 градусов по Цельсию. После ношения хирургической маски, перчаток и лабораторного халата отмерьте 40 граммов порошка PFA и добавьте его в нагретую воду, затем с помощью переносной пипетки добавьте в раствор несколько капель 5-молярного гидроксида натрия.
Дайте порошку полностью раствориться. Если порошок не полностью растворился, добавьте больше гидроксида натрия по мере необходимости. Как только весь PFA почти растворится, прекратите перемешивание и нагрев и немедленно добавьте 100 миллилитров 10x PBS, затем используйте воду молекулярно-биологического класса мощностью 18 миллиомом, чтобы долить стакан до 1-литровой отметки.
Накройте стакан полиэтиленовой пленкой и поместите его в морозильную камеру при минус 20 градусах Цельсия, пока раствор не достигнет комнатной температуры. После калибровки рН-метра с использованием соответствующих эталонов измерьте рН раствора, пока стакан находится на перемешивающей пластине. Добавляют соляную кислоту до тех пор, пока рН не достигнет 7,4.
Если рН слишком низкий, добавьте 5-молярный гидроксид натрия для повышения рН. Затем подключите вакуумную колбу для пылесоса и поместите в колбу чистую керамическую воронку Бюхнера с фильтровальной бумагой. После включения вакуума смочите фильтровальную бумагу с помощью трансферной пипетки, заполненной 4%-ным раствором PFA, затем медленно вылейте раствор на фильтровальную бумагу, пока весь раствор не будет отфильтрован.
После фильтрации храните раствор в защищенном от света контейнере при температуре 4 градуса Цельсия до использования. В вытяжной шкаф поместите рассекающий блок из пенополистирола в стеклянный лоток. Убедитесь, что блок рассечения имеет пять-шесть коротких игл для удержания мыши во время операции и две длинные иглы для поддержки перфузионной трубки.
Далее промыть перфузионный аппарат дистиллированной водой. После того, как вся вода слилась, повесьте обильные бутылки на один метр выше животного, чтобы его перфузировали, а затем приготовьте нестерильный 1x PBS, используя 10x PBS, разбавленный молекулярно-биологической водой. Зажмите основную линию перфузионного аппарата с помощью гемостата, затем зажмите линию PFA другим гемостатом.
После заполнения буферного контейнера PBS поместите шприцевой конец перфузионного аппарата в стакан для сбора буфера отходов и удаления гемостата, закупоривающего основную линию. Пока PBS течет по линии, энергично постукивайте по стенкам трубы, чтобы удалить захваченный воздух. После того, как весь воздух был удален из буферных и основных линий, закройте поток, поместив гемостат на основную линию.
Затем удалите гемостат из линии PFA, позволяя PBS течь ретроградным образом до бутылки PFA, выжимая любые пузырьки в линии PFA. Продолжайте допускать PBS в линию PFA до тех пор, пока она не будет видна чуть выше отверстия бутылки, затем закройте линию PFA гемостатом, чтобы остановить поток PBS в бутылку PFA. Затем подключите иглу инфузии бабочки к перфузионному шприцу и откройте гемостат основной линии, чтобы промыть PBS через линию и удалить пузырьки из перфузионного шприца.
После того, как пузырьки были удалены, закройте гемостат основной линии. Убедитесь, что бутылка PBS теперь примерно на 1/3 заполнена PBS. При необходимости промывайте PBS через основную линию или заполняйте больше PBS в буферную бутылку до 1/3 ее полной емкости.
После того, как все пузырьки будут удалены из PBS, PFA и основных линий, наполните бутылку PFA 4%-ным раствором PFA при комнатной температуре до черной отметки на бутылке. Затем подготовьтесь к операции, не связанной с выживанием, очистив необходимые инструменты сначала водой, а затем 70% этанолом. После закрепления анестезированной черной мыши C57 6J к блоку пенополистирола, начните операцию с поднятия кожи живота кожными щипцами и разрезания брюшной стенки большими ножницами.
Продолжайте брюшной разрез преимущественно по направлению к печени, затем отделите печень от передней брюшной стенки и продолжайте начальный разрез преимущественно к диафрагме. Когда разрез достигнет диафрагмы, используя мелкодисперсные ножницы, сделайте отверстие в диафрагме и прорежьте ребра на правой стороне мыши примерно на полпути к правой подмышечной впадине, затем сделайте аналогичный, но более длинный разрез через левую сторону диафрагмы почти до всей левой подмышечной впадины. Отразите грудную стенку и прикрепите ее к блоку пенополистирола.
После идентификации левого желудочка, используя тонко изогнутые щипцы, удерживайте сердце устойчивым с легким давлением, затем откройте гемостат основной линии, чтобы позволить PBS течь через иглу, и немедленно пронзите левый желудочек иглой. Убедитесь, что игла вставлена не более чем на 0,5 сантиметра в желудочек. Затем положите трубку бабочки на X, изготовленную из пенополистирола с двумя большими иглами 18-го калибра.
Определите нижнюю полую вену, когда она выходит из печени, и перерецензируйте ее с помощью тонкодисперсных ножниц. Продолжайте перфузию PBS до тех пор, пока жидкость, вытекающая из нижней полой вены, не будет свободна от крови, затем, работая быстро, закройте линию PBS гемостатом и откройте линию PFA. Дайте PFA перфусировать в течение нескольких минут, пока хвост не начнет скручиваться.
Как только хвост начнет скручиваться, начните 50-минутный таймер. Через 50 минут закупоривают основную линию гемостатом и выводят иглу из левого желудочка. Затем поместите мышь в маркированный контейнер с раствором PFA при температуре 4 градуса Цельсия на ночь.
На качественную перфузию указывает отсутствие крови в печени, спинном мозге и глубоких структурах центральной нервной системы. Кровь, наблюдаемая в головном мозге, расположена между черепом и твердой мозговой оболочкой и поэтому не является проблемой или наводящим на мысль о некачественной перфузии. Обнаружение альфа-синуклеина после этого метода перфузии показывает, что фосфорилированный альфа-синуклеин накапливается значительно выше у 15,5-месячных симптоматических мышей по сравнению с семимесячными бессимптомными мышами, экспрессирующими альфа-синуклеин A53T человека.
Этот результат согласуется с отчетами, описывающими обогащение цитопатологии в передних рогах спинного мозга и среднем мозге этих мышей. Важно, чтобы при доступе к грудной полости не разрезались органы брюшной полости. Кроме того, перфузионная игла не должна быть помещена слишком глубоко в левый желудочек.
