Este protocolo proporciona un método sencillo de perfusión fijadora en ratones que permitirá el estudio histológico de los tejidos del SNC sin inversión significativa. La principal ventaja del método de perfusión por gravedad presentado aquí es que el aparato de profusión se puede construir con componentes fácilmente disponibles. Demostrando el procedimiento estará Arnav Rana, un estudiante de MD-PhD del laboratorio del Dr. Xin Jie Chen.
Para comenzar, usando una cuchilla de afeitar afilada, recorte las pajitas internas de dos botellas de lavado de 500 mililitros cortándolas al ras del lado interno del tornillo de la tapa. Corte un agujero cuadrado de cuatro por cuatro centímetros en el fondo de cada botella tampón, luego corte otro pequeño orificio en el fondo de cada botella para permitir el paso de una micro espátula de acero inoxidable doblada. A continuación, cree una curva en forma de S en las espátulas de micros para que puedan usarse como ganchos para colgar las botellas tampón.
Inserte las micro espátulas dobladas en las aberturas apropiadas en las botellas tampón. A continuación, conecte firmemente dos tubos de 25 centímetros de largo con las salidas exteriores de paja de la botella y una los extremos de estos tubos junto con el conector Y, luego una la tubería de 2 metros de largo al extremo libre del conector Y. Después de quitar el émbolo de una jeringa de 1 mililitro, corte la jeringa aproximadamente a 6 centímetros de la punta anotando primero el plástico con una cuchilla de afeitar y luego rompiendo bruscamente el plástico de la jeringa.
Inserte la cara cortada de la jeringa en el extremo libre del tubo de plástico a una profundidad suficiente y asegúrese de un sellado hermético. A continuación, etiquete una botella tampón como PFA y la otra como PBS. Mida aproximadamente 1/3 de la longitud de la abertura de la botella y dibuje una línea alrededor de la circunferencia de la botella en este punto para denotar el nivel de llenado apropiado de las soluciones de perfusato.
Después de enderezar un clip grande, cree un bucle que pueda caber alrededor de la circunferencia del tubo y coloque este bucle alrededor del tubo, solo proximal a la jeringa, luego coloque un bloque de espuma de poliestireno del tamaño adecuado en la bandeja de vidrio, coloque los extremos del clip en el bloque de espuma de poliestireno para fijar el tubo y use una toalla de papel, eleve el extremo frontal de la bandeja de vidrio en aproximadamente 2 centímetros. Después de enjuagar un vaso de precipitados de 1 litro con agua destilada, llénelo con aproximadamente 800 mililitros de agua de grado de biología molecular de 18 milimohmios. Calienta el vaso de precipitados en un microondas durante tres minutos o hasta que la temperatura del agua alcance los 65 grados centígrados, luego colócalo en una placa de calentamiento o agitación guardada en una campana extractora de humos.
A continuación, enjuague una varilla de agitación con agua destilada y colóquela en el vaso de precipitados. Encienda el agitador y gire la placa caliente a fuego medio, asegurándose de que la temperatura del agua no supere los 70 grados centígrados. Después de usar una máscara quirúrgica, guantes y bata de laboratorio, mida 40 gramos de polvo de PFA y agréguelo al agua caliente, luego use una pipeta de transferencia, agregue unas gotas de hidróxido de sodio 5 molares a la solución.
Deje que el polvo se disuelva por completo. Si el polvo no se ha disuelto por completo, agregue más hidróxido de sodio según sea necesario. Una vez que todo el PFA casi se haya disuelto, detenga la agitación y el calentamiento e inmediatamente agregue 100 mililitros de 10x PBS, luego use el agua de grado de biología molecular de 18 milimohmios para recargar el vaso de precipitados hasta la marca de 1 litro.
Cubra el vaso de precipitados con una envoltura de plástico y colóquelo en un congelador de menos 20 grados centígrados hasta que la solución alcance la temperatura ambiente. Después de calibrar un medidor de pH utilizando los estándares apropiados, mida el pH de la solución mientras el vaso de precipitados está en una placa de agitación. Añadir ácido clorhídrico hasta que el pH alcance 7.4.
Si el pH es demasiado bajo, agregue hidróxido de sodio 5 molar para aumentar el pH. A continuación, conecte un matraz de vacío al vacío y coloque un embudo Buchner de cerámica limpia con papel de filtro en el matraz. Después de encender el vacío, humedezca el papel de filtro con una pipeta de transferencia llena con la solución de 4% de PFA, luego vierta lentamente la solución sobre el papel de filtro hasta que toda la solución se haya filtrado.
Después de filtrar, guarde la solución en un recipiente protegido contra la luz a 4 grados centígrados hasta su uso. En la campana de humos, coloque un bloque de disección de espuma de poliestireno en una bandeja de vidrio. Asegúrese de que el bloque de disección tenga de cinco a seis agujas cortas para sujetar al ratón durante la cirugía y dos agujas largas para soportar el tubo de perfusión.
A continuación, enjuague el aparato de perfusión con agua destilada. Después de que toda el agua se haya drenado, cuelgue las botellas de profusión un metro por encima del animal que se perfundirá, luego prepare 1x PBS no estéril usando 10x PBS diluido con agua de grado de biología molecular. Sujete la línea principal del aparato de perfusión con un hemostático, luego sujete la línea PFA con otro hemostático.
Después de llenar el recipiente tampón con PBS, coloque el extremo de la jeringa del aparato de perfusión en un vaso de precipitados para recoger el tampón de desechos y retire el hemostático ocluyendo la línea principal. Mientras el PBS fluye a través de la línea, golpee vigorosamente las paredes del tubo para eliminar el aire atrapado. Una vez que se haya eliminado todo el aire del amortiguador y las líneas principales, ocluya el flujo colocando un hemostático en la línea principal.
A continuación, retire el hemostático de la línea de PFA, permitiendo que el PBS fluya de manera retrógrada hasta la botella de PFA mientras extrae cualquier burbuja en la línea de PFA. Continúe permitiendo que el PBS entre en la línea de PFA hasta que se pueda ver justo encima de la abertura de la botella, luego ocluya la línea de PFA con un hemostático para detener el flujo de PBS en la botella de PFA. A continuación, conecte la aguja de infusión de mariposa a la jeringa de perfusión y abra el hemostático de la línea principal para eliminar el PBS a través de la línea y eliminar las burbujas de la jeringa de perfusión.
Después de que se hayan eliminado las burbujas, cierre el hemostático de la línea principal. Asegúrese de que la botella de PBS esté ahora aproximadamente 1/3 llena de PBS. Si es necesario, enjuague PBS a través de la línea principal o llene más PBS en la botella tampón hasta 1/3 de su capacidad máxima.
Una vez que se hayan eliminado todas las burbujas del PBS, PFA y líneas principales, llene la botella de PFA con una solución de PFA al 4% a temperatura ambiente hasta la marca negra en la botella. A continuación, prepárese para la cirugía de no supervivencia limpiando los instrumentos necesarios primero con agua y luego con etanol al 70%. Después de asegurar un ratón C57 negro 6J anestesiado al bloque de espuma de poliestireno, comience la cirugía levantando la piel abdominal con fórceps de piel y cortando la pared abdominal con tijeras grandes.
Continúe el corte abdominal superiormente hacia el hígado, luego separe el hígado de la pared abdominal anterior y continúe la incisión inicial superiormente hacia el diafragma. Cuando la incisión llegue al diafragma, usando tijeras de disección fina, haga un agujero en el diafragma y corte a través de las costillas en el lado derecho del ratón aproximadamente hasta la mitad de la axila derecha, luego haga una incisión similar, pero más larga a través del lado izquierdo del diafragma casi hasta la axila izquierda. Refleja la pared torácica y pégala al bloque de espuma de poliestireno.
Después de identificar el ventrículo izquierdo, use fórceps curvados finos, mantenga el corazón estable con una ligera presión, luego abra el hemostático de la línea principal para permitir que el PBS fluya a través de la aguja e inmediatamente perfore el ventrículo izquierdo con la aguja. Asegúrese de que la aguja se inserte no más de 0,5 centímetros en el ventrículo. A continuación, descanse el tubo de mariposa en una X hecha en espuma de poliestireno con dos agujas grandes de calibre 18.
Identifique la vena cava inferior a medida que sale del hígado y transecte con tijeras de disección fina. Continúe la perfusión de PBS hasta que el líquido que fluye de la vena cava inferior esté libre de sangre, luego trabaje rápidamente, ocluya la línea de PBS con un hemostático y abra la línea de PFA. Deje que el PFA se perfunda durante unos minutos hasta que la cola comience a curvarse.
Una vez que la cola comience a curvarse, comience un temporizador de 50 minutos. Después de 50 minutos, ocluya la línea principal con un hemostático y retire la aguja del ventrículo izquierdo. A continuación, coloque el ratón en un recipiente etiquetado de solución de PFA a 4 grados centígrados durante la noche.
La perfusión de alta calidad está indicada por la ausencia de sangre en el hígado, la médula espinal y las estructuras profundas del sistema nervioso central. La sangre observada en el cerebro se encuentra entre el cráneo y la duramadre y, por lo tanto, no es problemática o sugestiva de perfusión de mala calidad. La detección de alfa-sinucleína siguiendo este método de perfusión muestra que la alfa-sinucleína fosforilada se acumula significativamente más en ratones sintomáticos de 15,5 meses de edad en relación con ratones asintomáticos de siete meses de edad que expresan alfa-sinucleína A53T humana.
Este resultado es consistente con los informes que describen un enriquecimiento de la citopatología en los cuernos anteriores de la médula espinal y el mesencéfalo de estos ratones. Es importante que no se corten los órganos abdominales al acceder a la cavidad torácica. Además, la aguja de perfusión no debe colocarse demasiado profundamente dentro del ventrículo izquierdo.
