يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة للإرواء المثبت في الفئران التي ستسمح بالدراسة النسيجية لأنسجة الجهاز العصبي المركزي دون استثمار كبير. الميزة الرئيسية لطريقة تروية الجاذبية المعروضة هنا هي أنه يمكن بناء جهاز الوفرة بمكونات متاحة بسهولة. سيوضح الإجراء أرناف رنا ، طالب دكتوراه في الطب من مختبر الدكتور شين جي تشن.
للبدء ، باستخدام شفرة حلاقة حادة ، قم بقص القش الداخلي من زجاجتي غسيل سعة 500 ملليلتر عن طريق قطعهما إلى الجانب الداخلي من المسمار الموجود على الغطاء. قم بقص ثقب مربع بطول أربعة × أربعة سنتيمترات في الجزء السفلي من كل زجاجة عازلة ، ثم قم بقطع ثقب صغير آخر في قاع كل زجاجة للسماح بمرور ملعقة صغيرة من الفولاذ المقاوم للصدأ عازمة. بعد ذلك ، قم بإنشاء منحنى على شكل حرف S في ملاعق micros بحيث يمكن استخدامها كخطافات لتعليق زجاجات التخزين المؤقت.
أدخل الملاعق الدقيقة المنحنية في الفتحات المناسبة في زجاجات التخزين المؤقت. بعد ذلك ، قم بتوصيل أنبوبين بطول 25 سم بإحكام مع منافذ قش الزجاجة الخارجية وانضم إلى نهايات هذه الأنابيب مع موصل Y ، ثم انضم إلى الأنبوب الذي يبلغ طوله 2 متر إلى الطرف الحر لموصل Y. بعد إزالة المكبس من حقنة 1 ملليلتر ، اقطع المحقنة على بعد حوالي 6 سنتيمترات من الطرف عن طريق تسجيل البلاستيك أولا بشفرة حلاقة ثم التقاط البلاستيك المحقنة بحدة.
أدخل الوجه المقطوع للمحقنة في الطرف الحر للأنابيب البلاستيكية على عمق كاف وتأكد من وجود ختم محكم. بعد ذلك ، قم بتسمية زجاجة تخزين مؤقت واحدة باسم PFA والأخرى باسم PBS. قم بقياس حوالي 1/3 من الطول بعيدا عن فتحة الزجاجة وارسم خطا حول محيط الزجاجة عند هذه النقطة للإشارة إلى مستوى التعبئة المناسب لمحاليل العطر.
بعد تقويم مشبك ورق كبير ، قم بإنشاء حلقة يمكن أن تتناسب مع محيط الأنبوب ووضع هذه الحلقة حول الأنابيب ، بالقرب من المحقنة ، ثم ضع كتلة من الستايروفوم بحجم مناسب في الدرج الزجاجي ، وضع نهايات مشبك الورق في كتلة الستايروفوم لتثبيت الأنابيب واستخدام منشفة ورقية ، رفع الطرف الأمامي من الدرج الزجاجي بحوالي 2 سم. بعد شطف كوب سعة 1 لتر بالماء المقطر ، املأه بحوالي 800 ملليلتر من الماء الجزيئي من الدرجة 18 ملليمتر من البيولوجيا. سخني الكأس في الميكروويف لمدة ثلاث دقائق أو حتى تصل درجة حرارة الماء إلى 65 درجة مئوية ، ثم ضعيه على تسخين أو طبق تحريك محفوظ في غطاء الدخان.
بعد ذلك ، شطف قضيب التحريك بالماء المقطر ووضعه في الدورق. ابدأ تشغيل التحريك واقلب الصفيحة الساخنة حتى درجة حرارة متوسطة ، مما يضمن ألا تتجاوز درجة حرارة الماء 70 درجة مئوية. بعد ارتداء قناع جراحي وقفازات ومعطف مختبر ، قم بقياس 40 جراما من مسحوق PFA وأضفه إلى الماء الساخن ، ثم باستخدام ماصة نقل ، أضف بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم 5 مولار إلى المحلول.
اترك المسحوق يذوب بالكامل. إذا لم يذوب المسحوق بالكامل ، أضف المزيد من هيدروكسيد الصوديوم حسب الحاجة. بمجرد أن يذوب كل PFA تقريبا ، توقف عن التحريك والتسخين وأضف على الفور 100 ملليلتر من 10x PBS ، ثم استخدم الماء الجزيئي من فئة البيولوجيا 18 مللي أوم لزيادة الكأس إلى علامة 1 لتر.
غطي الكأس بغلاف بلاستيكي وضعيه في ثلاجة 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى يصل المحلول إلى درجة حرارة الغرفة. بعد معايرة مقياس الأس الهيدروجيني باستخدام المعايير المناسبة ، قم بقياس الرقم الهيدروجيني للمحلول أثناء وجود الكأس على لوحة تحريك. أضف حمض الهيدروكلوريك حتى يصل الرقم الهيدروجيني إلى 7.4.
إذا كان الرقم الهيدروجيني منخفضا جدا ، أضف هيدروكسيد الصوديوم 5-molar لزيادة الرقم الهيدروجيني. بعد ذلك ، قم بتوصيل قارورة فراغ بالتفريغ ووضع قمع Buchner من السيراميك النظيف مع ورق الترشيح في القارورة. بعد تشغيل الفراغ ، بلل ورق الترشيح باستخدام ماصة نقل مملوءة بمحلول PFA 4٪ ، ثم صب المحلول ببطء على ورق الترشيح حتى يتم تصفية كل المحلول.
بعد التصفية ، قم بتخزين المحلول في حاوية محمية بالضوء عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. في غطاء الدخان ، ضع كتلة تشريح الستايروفوم في صينية زجاجية. تأكد من أن كتلة التشريح تحتوي على خمس إلى ست إبر قصيرة لكبح جماح الفأر أثناء الجراحة وإبرتين طويلتين لدعم أنبوب التروية.
بعد ذلك ، شطف جهاز التروية بالماء المقطر. بعد أن تستنزف جميع المياه ، قم بتعليق زجاجات الغزيرة على ارتفاع متر واحد فوق الحيوان ليتم تشغيلها ، ثم قم بإعداد 1x PBS غير المعقمة باستخدام 10x PBS المخفف بالماء الجزيئي البيولوجي. قم بتثبيت الخط الرئيسي لجهاز التروية باستخدام مرقئ ، ثم قم بتثبيت خط PFA بمرقئ آخر.
بعد ملء الحاوية العازلة ب PBS ، ضع نهاية المحقنة لجهاز التروية في كوب لجمع المخزن المؤقت للنفايات وإزالة المرقئ الذي يسد الخط الرئيسي. بينما يتدفق PBS عبر الخط ، انقر بقوة على جدران الأنبوب لإزالة الهواء المحاصر. بمجرد إزالة كل الهواء من المخزن المؤقت والخطوط الرئيسية ، قم بحجب التدفق عن طريق وضع مرقئ على الخط الرئيسي.
بعد ذلك ، قم بإزالة المرقئ من خط PFA ، مما يسمح ل PBS بالتدفق بطريقة رجعية تصل إلى زجاجة PFA أثناء النقر على أي فقاعات في خط PFA. استمر في السماح ل PBS بالدخول إلى خط PFA حتى يمكن رؤيته فوق فتحة الزجاجة مباشرة ، ثم قم بإغلاق خط PFA بمرقئ لوقف تدفق PBS إلى زجاجة PFA. بعد ذلك ، قم بتوصيل إبرة تسريب الفراشة بحقنة التروية وافتح مرقئ الخط الرئيسي لطرد PBS عبر الخط وإزالة الفقاعات من حقنة التروية.
بعد إزالة الفقاعات، أغلق مرقئ الخط الرئيسي. تأكد من أن زجاجة PBS مليئة الآن بحوالي 1/3 من PBS. إذا لزم الأمر ، اغسل PBS عبر الخط الرئيسي أو املأ المزيد من PBS في زجاجة المخزن المؤقت حتى 1/3 من سعته الكاملة.
بمجرد إزالة جميع الفقاعات من PBS و PFA والخطوط الرئيسية ، املأ زجاجة PFA بمحلول PFA بنسبة 4٪ في درجة حرارة الغرفة حتى العلامة السوداء على الزجاجة. بعد ذلك ، استعد لجراحة عدم البقاء على قيد الحياة عن طريق تنظيف الأدوات اللازمة أولا بالماء ثم باستخدام 70٪ من الإيثانول. بعد تأمين فأر C57 أسود 6J مخدر إلى كتلة الستايروفوم ، ابدأ الجراحة عن طريق رفع جلد البطن بملقط الجلد وقطع جدار البطن بمقص كبير.
استمر في قطع البطن بشكل متفوق نحو الكبد ، ثم افصل الكبد عن جدار البطن الأمامي واستمر في الشق الأولي بشكل متفوق نحو الحجاب الحاجز. عندما يصل الشق إلى الحجاب الحاجز ، باستخدام مقص تشريح دقيق ، قم بعمل ثقب في الحجاب الحاجز وقطع الأضلاع على الجانب الأيمن من الماوس في منتصف الطريق تقريبا إلى الإبطين الأيمن ، ثم قم بعمل شق مماثل ، ولكن أطول من خلال الجانب الأيسر من الحجاب الحاجز تقريبا على طول الطريق إلى الإبطين الأيسر. اعكس جدار الصدر وقم بتثبيته على كتلة الستايروفوم.
بعد تحديد البطين الأيسر ، باستخدام ملقط منحني بدقة ، حافظ على ثبات القلب بضغط خفيف ، ثم افتح مرقئ الخط الرئيسي للسماح ل PBS بالتدفق عبر الإبرة واختراق البطين الأيسر على الفور باستخدام الإبرة. تأكد من إدخال الإبرة بما لا يزيد عن 0.5 سم في البطين. بعد ذلك ، ضع أنبوب الفراشة على X مصنوع في الستايروفوم مع إبرتين كبيرتين بمقياس 18.
تحديد الوريد الأجوف السفلي عند خروجه من الكبد ونقله باستخدام مقص تشريح دقيق. استمر في تروية PBS حتى يصبح السائل المتدفق من الوريد الأجوف السفلي خاليا من الدم ، ثم يعمل بسرعة ، ويسد خط PBS بمرقئ ويفتح خط PFA. اسمح ل PFA بالتجول لبضع دقائق حتى يبدأ الذيل في التجعد.
بمجرد أن يبدأ الذيل في التجعد ، ابدأ مؤقت مدته 50 دقيقة. بعد 50 دقيقة ، قم بسد الخط الرئيسي باستخدام مرقئ وسحب الإبرة من البطين الأيسر. بعد ذلك ، ضع الماوس في حاوية تحمل علامة من محلول PFA عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
يشار إلى التروية عالية الجودة من خلال عدم وجود دم في الكبد والحبل الشوكي وهياكل الجهاز العصبي المركزي العميقة. يقع الدم الذي لوحظ في الدماغ بين الجمجمة والأم الجافية ، وبالتالي فهو لا يمثل مشكلة أو يوحي بالتروية ذات النوعية الرديئة. يظهر الكشف عن ألفا سينوكلين باتباع طريقة التروية هذه أن ألفا سينوكلين المفسفرة تتراكم أعلى بكثير في الفئران التي تظهر عليها أعراض 15.5 شهرا مقارنة بالفئران عديمة الأعراض البالغة من العمر سبعة أشهر والتي تعبر عن A53T alpha-synuclein البشري.
وتتفق هذه النتيجة مع التقارير التي تصف إثراء علم الأمراض الخلوية في القرون الأمامية للحبل الشوكي والدماغ الأوسط لهذه الفئران. من المهم عدم قطع أعضاء البطن عند الوصول إلى التجويف الصدري. علاوة على ذلك ، يجب عدم وضع إبرة التروية بعمق كبير داخل البطين الأيسر.
