Questo protocollo fornisce un semplice metodo di perfusione fissativa nei topi che consentirà lo studio istologico dei tessuti del SNC senza investimenti significativi. Il vantaggio principale del metodo di perfusione per gravità qui presentato è che l'apparato di profusione può essere costruito con componenti facilmente disponibili. A dimostrare la procedura sarà Arnav Rana, uno studente MD-PhD del laboratorio del Dr.Xin Jie Chen.
Per iniziare, usando una lama di rasoio affilata, tagliare le cannucce interne da due bottiglie di lavaggio da 500 millilitri tagliandole a filo sul lato interno della vite sul tappo. Tagliare un foro quadrato di quattro per quattro centimetri sul fondo di ogni bottiglia tampone, quindi tagliare un altro piccolo foro sul fondo di ogni bottiglia per consentire il passaggio di una micro spatola in acciaio inossidabile piegata. Quindi, creare una curva a forma di S nelle micro spatole in modo che possano essere utilizzate come ganci per appendere le bottiglie tampone.
Inserire le micro spatole piegate nelle apposite aperture nelle bottiglie tampone. Quindi, collegare saldamente due tubi lunghi 25 centimetri con le uscite esterne della bottiglia di paglia e unire le estremità di questi tubi insieme al connettore a Y, quindi unire il tubo lungo 2 metri all'estremità libera del connettore a Y. Dopo aver rimosso lo stantuffo da una siringa da 1 millilitro, tagliare la siringa a circa 6 centimetri di distanza dalla punta segnando prima la plastica con una lama di rasoio e poi spezzando bruscamente la plastica della siringa.
Inserire la faccia tagliata della siringa nell'estremità libera del tubo di plastica a una profondità sufficiente e garantire una tenuta ermetica. Quindi, etichettare una bottiglia tampone come PFA e l'altra come PBS. Misurare circa 1/3 della lunghezza lontano dall'apertura della bottiglia e tracciare una linea attorno alla circonferenza della bottiglia a questo punto per indicare il livello di riempimento appropriato delle soluzioni perfusate.
Dopo aver raddrizzato una grande graffetta, creare un anello che possa adattarsi alla circonferenza del tubo e posizionare questo anello attorno al tubo, appena prossimale alla siringa, quindi posizionare un blocco di polistirolo di dimensioni appropriate nel vassoio di vetro, posizionare le estremità della graffetta nel blocco di polistirolo per fissare il tubo e utilizzare un tovagliolo di carta, sollevare l'estremità anteriore del vassoio di vetro di circa 2 centimetri. Dopo aver risciacquato un becher da 1 litro con acqua distillata, riempirlo con circa 800 millilitri di acqua di biologia molecolare da 18 milliohm. Riscaldare il becher in un forno a microonde per tre minuti o fino a quando la temperatura dell'acqua raggiunge i 65 gradi Celsius, quindi posizionarlo su un riscaldamento o una piastra di agitazione conservata in una cappa aspirante.
Quindi, sciacquare un'asta di agitazione con acqua distillata e metterla nel becher. Avviare l'agitatore e ruotare la piastra calda a fuoco medio, assicurandosi che la temperatura dell'acqua non superi i 70 gradi Celsius. Dopo aver indossato una maschera chirurgica, guanti e camice da laboratorio, misurare 40 grammi di polvere di PFA e aggiungerla nell'acqua riscaldata, quindi utilizzare una pipetta di trasferimento, aggiungere alcune gocce di idrossido di sodio 5-molare alla soluzione.
Lasciare che la polvere si sciolga completamente. Se la polvere non si è completamente dissolta, aggiungere più idrossido di sodio secondo necessità. Una volta che tutto il PFA si è quasi dissolto, interrompere l'agitazione e il riscaldamento e aggiungere immediatamente 100 millilitri di PBS 10x, quindi utilizzare l'acqua di biologia molecolare da 18 milliohm per rabboccare il becher al segno di 1 litro.
Coprire il becher con pellicola trasparente e metterlo in un congelatore a meno 20 gradi Celsius fino a quando la soluzione raggiunge la temperatura ambiente. Dopo aver calibrato un pHmetro utilizzando standard appropriati, misurare il pH della soluzione mentre il becher si trova su una piastra di agitazione. Aggiungere acido cloridrico fino a quando il pH raggiunge 7,4.
Se il pH è troppo basso, aggiungere idrossido di sodio 5-molare per aumentare il pH. Quindi, collegare un pallone sottovuoto per aspirare e posizionare un imbuto Buchner in ceramica pulita con carta da filtro nel pallone. Dopo aver acceso il vuoto, bagnare la carta da filtro utilizzando una pipetta di trasferimento riempita con la soluzione al 4% di PFA, quindi versare lentamente la soluzione sulla carta da filtro fino a quando tutta la soluzione non è stata filtrata.
Dopo il filtraggio, conservare la soluzione in un contenitore protetto dalla luce a 4 gradi Celsius fino all'uso. Nella cappa aspirante, posizionare un blocco di dissezione in polistirolo in un vassoio di vetro. Assicurarsi che il blocco di dissezione abbia da cinque a sei aghi corti per trattenere il topo durante l'intervento chirurgico e due aghi lunghi per supportare il tubo di perfusione.
Quindi, risciacquare l'apparato di perfusione con acqua distillata. Dopo che tutta l'acqua è stata drenata, appendere le bottiglie di profusione un metro sopra l'animale da perfusare, quindi preparare 1x PBS non sterile usando 10x PBS diluito con acqua di biologia molecolare. Bloccare la linea principale dell'apparato di perfusione usando un emostato, quindi bloccare la linea PFA con un altro emostato.
Dopo aver riempito il contenitore tampone con PBS, posizionare l'estremità della siringa dell'apparecchio di perfusione in un becher per raccogliere il tampone di scarto e rimuovere l'emostato che occlude la linea principale. Mentre il PBS scorre attraverso la linea, picchietta vigorosamente sulle pareti del tubo per rimuovere l'aria intrappolata. Una volta che tutta l'aria è stata rimossa dal buffer e dalle linee principali, occludere il flusso posizionando un emostato sulla linea principale.
Quindi, rimuovere l'emostato dalla linea PFA, consentendo al PBS di fluire in modo retrogrado fino alla bottiglia pfament mentre si estraggono eventuali bolle nella linea PFA. Continuare a consentire al PBS di entrare nella linea PFA fino a quando non può essere visto appena sopra l'apertura della bottiglia, quindi occludere la linea PFA con un emostato per interrompere il flusso di PBS nella bottiglia PFA. Quindi, collegare l'ago per infusione a farfalla alla siringa per perfusione e aprire l'emostato della linea principale per lavare PBS attraverso la linea e rimuovere le bolle dalla siringa di perfusione.
Dopo che le bolle sono state rimosse, chiudere l'emostato della linea principale. Assicurarsi che la bottiglia PBS sia ora piena di PBS per circa 1/3. Se necessario, lavare PBS attraverso la linea principale o riempire più PBS nella bottiglia tampone fino a 1/3 della sua piena capacità.
Una volta che tutte le bolle sono state rimosse dalle linee PBS, PFA e principali, riempire il flacone di PFA con una soluzione di PFA al 4% a temperatura ambiente fino al segno nero sul flacone. Quindi, prepararsi per la chirurgia di non sopravvivenza pulendo gli strumenti necessari prima con acqua e poi con etanolo al 70%. Dopo aver fissato un mouse nero 6J C57 anestetizzato al blocco di polistirolo, iniziare l'intervento chirurgico sollevando la pelle addominale con una pinza cutanea e tagliando la parete addominale con grandi forbici.
Continuare il taglio addominale in modo superiore verso il fegato, quindi staccare il fegato dalla parete addominale anteriore e continuare l'incisione iniziale in modo superiore verso il diaframma. Quando l'incisione raggiunge il diaframma, usando forbici a dissezione fine, fai un buco nel diaframma e taglia le costole sul lato destro del topo approssimativamente a metà strada verso l'ascella destra, quindi fai un'incisione simile, ma più lunga attraverso il lato sinistro del diaframma quasi fino all'ascella sinistra. Rifletti la parete toracica e fissala al blocco di polistirolo.
Dopo aver identificato il ventricolo sinistro, utilizzando una pinza curva fine, tenere il cuore fermo con una leggera pressione, quindi aprire l'emostato della linea principale per consentire al PBS di fluire attraverso l'ago e perforare immediatamente il ventricolo sinistro con l'ago. Assicurarsi che l'ago sia inserito non più di 0,5 centimetri nel ventricolo. Quindi, appoggiare il tubo a farfalla su una X realizzata in polistirolo con due grandi aghi calibro 18.
Identificare la vena cava inferiore mentre esce dal fegato e transect con forbici a dissezione fine. Continuare la perfusione PBS fino a quando il liquido che fuoriesce dalla vena cava inferiore è privo di sangue, quindi lavorando rapidamente, occludere la linea PBS con un emostato e aprire la linea PFA. Lasciare che il PFA si perfonda per alcuni minuti fino a quando la coda inizia ad arricciarsi.
Una volta che la coda inizia ad arricciarsi, inizia un timer di 50 minuti. Dopo 50 minuti, occludere la linea principale con un emostato e prelevare l'ago dal ventricolo sinistro. Quindi, posizionare il mouse in un contenitore etichettato di soluzione di PFA a 4 gradi Celsius durante la notte.
La perfusione di alta qualità è indicata dall'assenza di sangue nel fegato, nel midollo spinale e nelle strutture profonde del sistema nervoso centrale. Il sangue osservato nel cervello si trova tra il cranio e la dura madre e non è quindi problematico o indicativo di una perfusione di scarsa qualità. L'individuazione di alfa-sinucleina a seguito di questo metodo di perfusione mostra che l'alfa-sinucleina fosforilata si accumula significativamente più in topi sintomatici di 15,5 mesi rispetto a topi asintomatici di sette mesi che esprimono alfa-sinucleina A53T umana.
Questo risultato è coerente con i rapporti che descrivono un arricchimento della citopatologia nelle corna anteriori del midollo spinale e nel mesencefalo di questi topi. È importante che nessun organo addominale venga tagliato quando si accede alla cavità toracica. Inoltre, l'ago per perfusione non deve essere posizionato troppo in profondità all'interno del ventricolo sinistro.
