Bu protokol, farelerde önemli bir yatırım yapmadan CNS dokularının histolojik olarak incelenmesine izin verecek basit bir fiksatif perfüzyon yöntemi sağlar. Burada sunulan yerçekimi perfüzyon yönteminin temel avantajı, profüzyon aparatının kolayca bulunabilen bileşenlerle inşa edilebilmesidir. Prosedürü gösteren, Dr. Xin Jie Chen'in laboratuvarından bir MD-PhD öğrencisi olan Arnav Rana olacak.
Başlamak için, keskin bir tıraş bıçağı kullanarak, iç pipetleri iki adet 500 mililitrelik yıkama şişesinden, kapaktaki vidanın iç tarafına hizalayarak kesin. Her tampon şişesinin dibinde dörte dört santimetrekarelik bir delik kesin, ardından bükülmüş paslanmaz çelik mikro spatulanın geçişine izin vermek için her şişenin dibinde başka bir küçük delik açın. Daha sonra, mikros spatulalarda S şeklinde bir büküm oluşturun, böylece tampon şişelerini asmak için kanca olarak kullanılabilirler.
Bükülmüş mikro spatulaları tampon şişelerindeki uygun açıklıklara yerleştirin. Ardından, 25 santimetre uzunluğundaki iki tüpü dış şişe saman çıkışlarına sıkıca bağlayın ve bu tüplerin uçlarını Y konektörü ile birleştirin, ardından 2 metre uzunluğundaki boruyu Y konektörünün serbest ucuna birleştirin. Pistonu 1 mililitrelik bir şırıngadan çıkardıktan sonra, önce plastiği bir tıraş bıçağı ile puanlayarak ve ardından şırınga plastiğini keskin bir şekilde yakalayarak şırıngayı uçtan yaklaşık 6 santimetre uzağa kesin.
Şırınganın kesilmiş yüzünü plastik borunun serbest ucuna yeterli derinliğe kadar yerleştirin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlayın. Ardından, bir tampon şişesini PFA, diğerini PBS olarak etiketleyin. Şişe açıklığından yaklaşık 1 / 3 uzaktaki uzunluğu ölçün ve perfüzyon çözeltilerinin uygun dolum seviyesini belirtmek için bu noktada şişe çevresinin etrafına bir çizgi çizin.
Büyük bir ataşı düzelttikten sonra, borunun çevresine sığabilecek bir halka oluşturun ve bu halkayı borunun etrafına, şırıngaya sadece yakınına yerleştirin, ardından cam tepsiye uygun boyutta bir Strafor blok yerleştirin, boruyu yapıştırmak için ve bir kağıt havlu kullanarak ataşın uçlarını strafor bloğa yerleştirin, cam tepsinin ön ucunu yaklaşık 2 santimetre yükseltin. 1 litrelik bir beheri damıtılmış suyla duruladıktan sonra, yaklaşık 800 mililitre 18 miliohm moleküler-biyoloji sınıfı su ile doldurun. Beheri bir mikrodalgada üç dakika veya su sıcaklığı 65 santigrat dereceye ulaşana kadar ısıtın, ardından bir duman davlumbazında tutulan bir ısıtma veya karıştırma plakasına yerleştirin.
Daha sonra, bir karıştırma çubuğunu damıtılmış suyla durulayın ve beherin içine yerleştirin. Karıştırıcıyı çalıştırın ve sıcak plakayı orta ateşe kadar çevirerek su sıcaklığının 70 santigrat derecenin üzerine çıkmamasını sağlayın. Cerrahi maske, eldiven ve laboratuvar önlüğü giydikten sonra, 40 gram PFA tozu ölçün ve ısıtılmış suya ekleyin, ardından bir transfer pipeti kullanarak, çözeltiye birkaç damla 5 molar sodyum hidroksit ekleyin.
Tozun tamamen çözünmesine izin verin. Toz tamamen çözülmemişse, gerektiğinde daha fazla sodyum hidroksit ekleyin. Tüm PFA neredeyse çözündükten sonra, karıştırmayı ve ısıtmayı durdurun ve hemen 100 mililitre 10x PBS ekleyin, ardından beheri 1 litrelik işarete doldurmak için 18 miliohm moleküler-biyoloji sınıfı suyu kullanın.
Beheri plastik ambalajla örtün ve çözelti oda sıcaklığına ulaşana kadar eksi 20 santigrat derece dondurucuya yerleştirin. Uygun standartları kullanarak bir pH metreyi kalibre ettikten sonra, beher karıştırma plakası üzerindeyken çözeltinin pH'ını ölçün. pH 7.4'e ulaşana kadar hidroklorik asit ekleyin.
pH çok düşükse, pH'ı artırmak için 5 molar sodyum hidroksit ekleyin. Ardından, vakumlamak için bir vakum şişesi bağlayın ve şişeye filtre kağıdı ile temiz bir seramik Buchner hunisi yerleştirin. Vakumu açtıktan sonra, filtre kağıdını %4 PFA çözeltisiyle doldurulmuş bir transfer pipeti kullanarak ıslatın, ardından tüm çözelti filtrelenene kadar çözeltiyi yavaşça filtre kağıdına dökün.
Filtrelemeden sonra, çözeltiyi kullanıma kadar 4 santigrat derecede hafif korumalı bir kapta saklayın. Duman davlumbazında, bir cam tepsiye bir Strafor diseksiyon bloğu yerleştirin. Diseksiyon bloğunun ameliyat sırasında fareyi kısıtlamak için beş ila altı kısa iğneye ve perfüzyon tüpünü desteklemek için iki uzun iğneye sahip olduğundan emin olun.
Daha sonra, perfüzyon aparatını damıtılmış suyla durulayın. Tüm su boşaldıktan sonra, bolluk şişelerini perfüze edilecek hayvanın bir metre yukarısına asın, ardından moleküler-biyoloji-sınıf su ile seyreltilmiş 10x PBS kullanarak steril olmayan 1x PBS hazırlayın. Perfüzyon aparatının ana hattını bir hemostat kullanarak kelepçeleyin, ardından PFA hattını başka bir hemostatla sıkıştırın.
Tampon kabını PBS ile doldurduktan sonra, atık tamponunu toplamak ve ana hattı tıkayan hemostatı çıkarmak için perfüzyon aparatının şırınga ucunu bir beher içine yerleştirin. PBS hat boyunca akarken, sıkışmış havayı gidermek için tüpün duvarlarına kuvvetlice dokunun. Tüm hava tampondan ve ana hatlardan çıkarıldıktan sonra, ana hatta bir hemostat yerleştirerek akışı engelleyin.
Daha sonra, hemostatı PFA hattından çıkarın ve PFA hattındaki kabarcıklara dokunurken PBS'nin PFA şişesine kadar geriye dönük bir şekilde akmasına izin verin. PBS'nin şişenin açıklığının hemen üzerinde görülene kadar PFA hattına girmesine izin vermeye devam edin, ardından PBS'nin PFA şişesine akışını durdurmak için PFA hattını bir hemostatla tıkayın. Daha sonra, kelebek infüzyon iğnesini perfüzyon şırıngasına bağlayın ve PBS'yi hat boyunca yıkamak ve perfüzyon şırıngasından kabarcıkları çıkarmak için ana hat hemostatını açın.
Kabarcıklar çıkarıldıktan sonra, ana hat hemostatını kapatın. PBS şişesinin şu anda yaklaşık 1/3'ünün PBS dolu olduğundan emin olun. Gerekirse, PBS'yi ana hattan yıkayın veya tam kapasitesinin 1/3'üne kadar tampon şişesine daha fazla PBS doldurun.
Tüm kabarcıklar PBS, PFA ve ana hatlardan çıkarıldıktan sonra, PFA şişesini, şişe üzerindeki siyah işarete kadar oda sıcaklığında% 4 PFA çözeltisi ile doldurun. Daha sonra, gerekli aletleri önce su ile, sonra% 70 etanol ile temizleyerek hayatta kalmama ameliyatına hazırlanın. Anestezi uygulanmış bir C57 siyah 6J fareyi strafor bloğa sabitledikten sonra, karın derisini deri forseps ile kaldırarak ve karın duvarını büyük makasla keserek ameliyata başlayın.
Karın kesimini karaciğere doğru üstünce devam ettirin, daha sonra karaciğeri ön karın duvarından ayırın ve ilk insizyonu diyaframa doğru üstün bir şekilde devam ettirin. Kesi diyaframa ulaştığında, ince diseksiyon makası kullanarak, diyaframda bir delik açın ve farenin sağ tarafındaki kaburgaları sağ aksillanın yaklaşık yarısına kadar kesin, ardından diyaframın sol tarafından neredeyse sol aksillaya kadar benzer, ancak daha uzun bir kesi yapın. Göğüs duvarını yansıtın ve strafor bloğuna sabitleyin.
Sol ventrikülü tanımladıktan sonra, ince kavisli forseps kullanarak, kalbi hafif basınçla sabit tutun, ardından PBS'nin iğneden akmasına izin vermek için ana hat hemostatını açın ve hemen sol ventrikülü iğneyle delin. İğnenin ventriküle en fazla 0,5 santimetre sokulmadığından emin olun. Daha sonra, kelebek borusunu iki büyük 18 gauge iğne ile strafordan yapılmış bir X üzerinde dinlendirin.
İnferior vena kavayı karaciğerden çıkarken tanımlayın ve ince diseksiyon makası kullanarak transekte edin. İnferior vena kavadan akan sıvı kansız olana kadar PBS perfüzyonuna devam edin, daha sonra hızlı bir şekilde çalışın, PBS hattını bir hemostatla tıkayın ve PFA hattını açın. PFA'nın kuyruk kıvrılmaya başlayana kadar birkaç dakika boyunca perfüzyona izin verin.
Kuyruk kıvrılmaya başladığında, 50 dakikalık bir zamanlayıcıya başlayın. 50 dakika sonra, ana hattı bir hemostat ile tıkayın ve iğneyi sol ventrikülden çekin. Ardından, fareyi gece boyunca 4 santigrat derecede etiketli bir PFA çözeltisi kabına yerleştirin.
Yüksek kaliteli perfüzyon, karaciğerde, omurilikte ve derin merkezi sinir sistemi yapılarında kan bulunmaması ile gösterilir. Beyinde gözlenen kan, kafatası ve dura mater arasında bulunur ve bu nedenle sorunlu veya düşük kaliteli perfüzyonu düşündüren bir şey değildir. Bu perfüzyon yöntemini takiben alfa-sinükleinin saptanması, fosforile alfa-sinükleinin, insan A53T alfa-sinükleini eksprese eden yedi aylık asemptomatik farelere kıyasla 15.5 aylık semptomatik farelerde anlamlı derecede daha yüksek biriktiğini göstermektedir.
Bu sonuç, omuriliğin ön boynuzlarında ve bu farelerin orta beyninde sitopatolojinin zenginleşmesini tanımlayan raporlarla tutarlıdır. Göğüs boşluğuna erişirken hiçbir karın organının kesilmemesi önemlidir. Ayrıca, perfüzyon iğnesi sol ventrikül içine çok derin yerleştirilmemelidir.
