이 프로토콜은 상당한 투자 없이 CNS 조직의 조직학적 연구를 가능하게 하는 마우스에서의 고정적 관류의 간단한 방법을 제공한다. 여기에 제시된 중력 관류 방법의 주요 장점은 확산 장치가 쉽게 이용 가능한 구성 요소로 구성 될 수 있다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 Xin Jie Chen 박사의 실험실에서 MD-PhD 학생 인 Arnav Rana가 될 것입니다.
시작하려면 날카로운 면도날을 사용하여 두 개의 500 밀리리터 세척 병에서 내부 빨대를 뚜껑의 나사 안쪽으로 플러시로 절단하여 다듬습니다. 각 버퍼 병의 바닥에 네 x 네 센티미터 정사각형 구멍을 자른 다음 구부러진 스테인레스 스틸 마이크로 주걱을 통과 할 수 있도록 각 병 바닥에 또 다른 작은 구멍을 자릅니다. 다음으로, 마이크로 주걱에 S 자형 굴곡을 만들어 버퍼 병을 매달기위한 후크로 사용할 수 있도록하십시오.
구부러진 마이크로 주걱을 버퍼 병의 적절한 구멍에 넣으십시오. 그런 다음 25cm 길이의 튜브 두 개를 외부 병 짚 배출구와 단단히 연결하고 Y 커넥터와 함께이 튜브의 끝을 결합 한 다음 2 미터 길이의 튜브를 Y 커넥터의 자유 끝에 결합하십시오. 1 밀리리터 주사기에서 플런저를 제거한 후 먼저 면도날로 플라스틱을 채점한 다음 주사기 플라스틱을 날카롭게 스냅하여 팁에서 약 6cm 떨어진 곳에 주사기를 자릅니다.
주사기의 절단면을 플라스틱 튜브의 자유 끝에 충분한 깊이로 삽입하고 밀봉을 단단히 고정하십시오. 다음으로, 하나의 완충 병을 PFA로 라벨링하고 다른 하나는 PBS로 라벨링하십시오. 병 개구부에서 약 1/3 떨어진 길이를 측정하고이 시점에서 병 둘레 주위에 선을 그려 향수 용액의 적절한 충전 수준을 나타냅니다.
큰 종이 클립을 곧게 펴고 튜브의 둘레 주위에 들어갈 수있는 루프를 만들고 주사기에 바로 근접한이 루프를 튜브 주위에 놓은 다음 적절한 크기의 스티로폼 블록을 유리 트레이에 놓고 종이 클립의 끝을 스티로폼 블록에 넣어 튜브를 부착하고 종이 타월을 사용하여 유리 트레이의 앞쪽 끝을 약 2 센티미터 정도 올립니다. 1 리터 비커를 증류수로 헹구고 나서 약 800 밀리리터의 18 밀리옴 분자 생물학 등급 물로 채 웁니다. 비커를 전자 레인지에서 3 분 동안 가열하거나 수온이 섭씨 65도에 도달 할 때까지 가열 한 다음 흄 후드에 보관 된 가열 또는 교반 플레이트 위에 놓습니다.
다음으로, 교반 막대를 증류수로 헹구고 비이커에 넣으십시오. 교반기를 시작하고 핫 플레이트를 중간 열로 돌려 수온이 섭씨 70도를 넘지 않도록하십시오. 외과 용 마스크, 장갑 및 실험실 코트를 착용 한 후 PFA 분말 40g을 측정하여 가열 된 물에 넣은 다음 이송 피펫을 사용하여 용액에 5 몰 수산화 나트륨 몇 방울을 첨가하십시오.
분말이 완전히 용해되도록 하십시오. 분말이 완전히 용해되지 않은 경우 필요에 따라 수산화 나트륨을 더 첨가하십시오. 모든 PFA가 거의 용해되면 교반 및 가열을 중단하고 즉시 10x PBS 100 밀리리터를 첨가 한 다음 18 밀리옴 분자 생물학 등급 물을 사용하여 비커를 1 리터 마크로 충전하십시오.
비커를 플라스틱 랩으로 덮고 용액이 실온에 도달 할 때까지 영하 20도 냉동실에 보관하십시오. 적절한 표준을 사용하여 pH 미터를 교정 한 후, 비커가 교반 플레이트 상에있는 동안 용액의 pH를 측정하십시오. pH가 7.4에 도달 할 때까지 염산을 첨가하십시오.
pH가 너무 낮으면 5몰 수산화나트륨을 첨가하여 pH를 증가시킨다. 다음으로, 진공 플라스크를 진공에 연결하고 플라스크에 여과지가있는 깨끗한 세라믹 Buchner 깔때기를 놓습니다. 진공을 켠 후 4 % PFA 용액으로 채워진 전사 피펫을 사용하여 여과지를 적신 다음 모든 용액이 여과 될 때까지 용액을 여과지에 천천히 붓습니다.
여과 후, 용액을 사용할 때까지 섭씨 4도의 빛 보호 용기에 보관하십시오. 흄 후드에 스티로폼 해부 블록을 유리 트레이에 놓습니다. 해부 블록에 수술 중 마우스를 제지하기 위해 다섯 개에서 여섯 개의 짧은 바늘이 있고 관류 튜브를지지하는 두 개의 긴 바늘이 있는지 확인하십시오.
다음으로, 관류 장치를 증류수로 헹구십시오. 모든 물이 배수된 후, 관류될 동물 위에 1미터 높이의 증식병을 걸어놓고, 분자생물학등급의 물로 희석된 10x PBS를 사용하여 멸균되지 않은 1x PBS를 제조하였다. 지혈제를 사용하여 관류 장치의 메인 라인을 클램프 한 다음 PFA 라인을 다른 지혈제로 클램프하십시오.
완충 용기를 PBS로 충전한 후, 관류 장치의 주사기 말단을 비이커에 넣어 폐기물 버퍼를 수집하고 본선을 폐색시키는 지혈제를 제거한다. PBS가 라인을 통해 흐르는 동안 튜브의 벽을 힘차게 탭하여 갇힌 공기를 제거하십시오. 버퍼와 메인 라인에서 모든 공기가 제거되면 메인 라인에 지혈제를 배치하여 흐름을 막으십시오.
다음으로, PFA 라인으로부터 지혈제를 제거하여, PBS가 PFA 라인 내의 임의의 기포를 두드리면서 PFA 병까지 역행 방식으로 유동하도록 허용한다. 병의 개구부 바로 위에서 볼 수 있을 때까지 PBS를 PFA 라인 내로 계속 허용하고, 이어서 PFA 병 내로의 PBS의 유동을 중단시키기 위해 지혈제로 PFA 라인을 폐색시킨다. 다음으로, 나비 주입 바늘을 관류 주사기에 연결하고 메인 라인 지혈제를 열어 PBS를 라인을 통해 플러시하고 관류 주사기에서 기포를 제거한다.
거품이 제거 된 후 메인 라인 지혈제를 닫으십시오. PBS 병이 이제 PBS로 약 1/3 가득 차 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 메인 라인을 통해 PBS를 플러시하거나 전체 용량의 1/3이 될 때까지 버퍼 병에 더 많은 PBS를 채 웁니다.
PBS, PFA 및 메인 라인에서 모든 기포가 제거되면 병의 검은 색 표시까지 실온에서 4 % PFA 용액으로 PFA 병을 채 웁니다. 다음으로, 필요한 도구를 먼저 물로 닦은 다음 70 % 에탄올로 비 생존 수술을 준비하십시오. 마취된 C57 블랙 6J 마우스를 스티로폼 블록에 고정시킨 후, 피부 포셉으로 복부 피부를 들어 올리고 큰 가위로 복벽을 절단하여 수술을 시작하십시오.
복부를 간쪽으로 우월하게 자른 다음 전방 복벽에서 간을 분리하고 횡격막 쪽으로 우월하게 초기 절개를 계속하십시오. 절개가 횡격막에 도달하면 미세 해부 가위를 사용하여 횡격막에 구멍을 뚫고 마우스 오른쪽의 갈비뼈를 오른쪽 겨드랑이의 절반 정도를 자른 다음 횡격막의 왼쪽을 통해 거의 모든 방법을 왼쪽 겨드랑이까지 비슷하지만 더 긴 절개를하십시오. 가슴 벽을 반사하고 스티로폼 블록에 고정하십시오.
좌심실을 확인한 후 미세한 곡선 포셉을 사용하여 가벼운 압력으로 심장을 일정하게 잡은 다음 PBS가 바늘을 통해 흐를 수 있도록 메인 라인 지혈제를 열고 즉시 바늘로 좌심실을 관통합니다. 바늘이 심실에 0.5 센티미터 이상 삽입되지 않도록하십시오. 다음으로, 두 개의 큰 18 게이지 바늘이있는 스티로폼으로 만든 X에 나비 튜브를 놓습니다.
열등한 정맥 카바가 간을 빠져 나와 미세 해부하는 가위를 사용하여 횡단하는 것을 확인하십시오. 열등한 베나카바로부터 유출된 액체가 혈액이 없을 때까지 PBS 관류를 계속하고, 이어서 신속하게 작동시키고, 지혈제로 PBS 라인을 폐색시키고 PFA 라인을 개방한다. 꼬리가 말리기 시작할 때까지 PFA가 몇 분 동안 관류되도록 허용하십시오.
꼬리가 말리기 시작하면 50 분 타이머를 시작하십시오. 50 분 후, 지혈제로 메인 라인을 폐색하고 좌심실에서 바늘을 뽑습니다. 다음에, 마우스를 밤새 섭씨 4도에서 PFA 용액의 표지된 용기에 넣는다.
고품질 관류는 간, 척수 및 깊은 중추 신경계 구조에 혈액이 없음으로 나타납니다. 뇌에서 관찰 된 혈액은 두개골과 경막 사이에 위치하므로 품질이 좋지 않은 관류에 문제가 없거나 암시하지 않습니다. 이 관류 방법에 따른 알파 시누클레인의 검출은 인산화된 알파-시누클레인이 인간 A53T 알파-시누클레인을 발현하는 7개월 된 무증상 마우스에 비해 15.5개월 된 증상 마우스에서 유의하게 더 높게 축적된다는 것을 보여준다.
이 결과는 척수의 전방 뿔과 이들 마우스의 중뇌에서 세포 병리학의 풍부함을 설명하는 보고서와 일치합니다. 흉강에 접근 할 때 복부 장기를 절단하지 않는 것이 중요합니다. 또한, 관류 바늘은 좌심실 내에 너무 깊이 배치되어서는 안됩니다.
