Высокомультиплексная вибрационная визуализация обеспечивает однократный оптический подход для опроса нескольких белковых маркеров в тканях с субклеточным разрешением. Данная платформа дает исчерпывающую картину белковых взаимодействий биологических систем. Основным преимуществом этой методики является ее безцикловая мультиплексность.
Этот метод особенно подходит для применений, где велосипедные стратегии не функционируют хорошо, например, в толстых срезах тканей. Этот метод позволяет проводить индивидуальную характеристику клеток in situ для понимания структур сложной системы, таких как построение атласа тканей, фенотипирование микросред опухоли и схема профилирования мозга. Для начала приготовьте примерно 0,1 молярного бикарбоната натрия в буфере PBS при PHA 0,3 для использования в качестве буфера сопряжения и храните его при четырех градусах Цельсия.
Затем готовят три миллимолярных н-гидроксисукцинимида с функционирующим эфиром зонда MARS в безводном диметилсульфоксиде. Растворяют твердые антитела в буфере конъюгации до концентрации двух миллиграммов на миллилитр. Для антител, растворенных в других буферах, концентрируют их в центробежном фильтре, а затем добавляют в буфер конъюгации до концентрации от одного до двух миллиграммов на миллилитр.
Для выполнения реакции конъюгации для вторичных антител добавляют 15-кратное молярное избыток раствора красителя к раствору антител в стеклянный флакон медленно при перемешивании и инкубируют реакционную смесь при комнатной температуре с перемешиванием в течение одного часа. Для выполнения очистки подготовьте суспензию, добавив 10 миллилитров порошка гелевой фильтрационной смолы в 40 миллилитров буфера PBS в 50-миллилитровой трубке. Держите раствор на водяной бане при температуре 90 градусов Цельсия в течение одного часа.
Затем декантируйте супернатант, добавьте PBS до 40 миллилитров и храните суспензию при четырех градусах Цельсия. Упакуйте колонну исключения размеров раствором навозной жижи на высоту от 10 до 15 сантиметров, затем промойте и промыть колонну примерно 10 миллилитрами PBS для дальнейшей упаковки смолы. Впоследствии пипетку конъюгируют реакционную смесь в колонну.
После загрузки реакционной смеси немедленно добавьте один миллилитр PBS в качестве буфера элюирования. После этого соберите элюент сопряженного раствора, посмотрев на цвет на колонке или измерив поглощение на 280 нанометрах. Используя центробежный фильтр, концентрируйте собранный раствор до одного-двух миллиграммов на миллилитр.
С помощью гидрофобной ручки проведите границу вокруг участков ткани на слайде. Затем инкубируют ткани с 0,3 до 0,5% PBST в течение 10 минут и блокирующим буфером в течение 30 минут. Для приготовления первичного окрашивающего раствора добавляют все первичные антитела к 200-500 микролитрам окрашивающего буфера при желаемых концентрациях.
Центрифугируйте первичный окрашивающий раствор в 13 000 раз G в течение пяти минут и используйте супернатант при появлении осадка. Затем инкубируют ткань в растворе первичного антитела при четырех градусах Цельсия в течение одного-двух дней. Трижды вымойте горки с 0,3 до 0,5% PBST в течение пяти минут при комнатной температуре в стеклянной банке и убедитесь, что ткани погружены в раствор.
Позже инкубируют ткань в 200-500 микролитрах блокирующего буфера в течение 30 минут. Для приготовления вторичного окрашивающего раствора добавляют все вторичные антитела к 200-500 миллилитрам окрашивающего буфера с желаемыми концентрациями. Затем центрифугируют раствор вторичного окрашивания в 13 000 раз G в течение пяти минут и используют супернатант, если появляется осадок.
Далее инкубируют ткани в 200-500 микролитрах раствора вторичных антител при четырех градусах Цельсия в течение одного-двух дней. Затем дважды промывайте горки с 0,3 до 0,5% PBST при комнатной температуре в течение пяти минут каждая. Далее инкубируют с 200-500 микролитрами раствора DAPI в течение 30 минут.
Опять же, трижды вымойте горки PBS при комнатной температуре в течение пяти минут каждая и перенесите плавающие участки ткани на стеклянные горки с пипеткой. Выложите ткань тканевой щеткой и при необходимости очистите окружающую среду салфетками. Впоследствии смонтируйте ткань в каплю антивядящих реагентов стеклянным чехлом и закрепите ее лаком для ногтей.
Для выполнения многоканальной визуализации eprSRS установите мощность лазерного луча накачки на 10-40 милливатт, а луча стокса на 40-80 милливатт на панели управления лазера. Затем установите время ожидания пикселя на две-четыре микросекунды и используйте несколько кадров в среднем от 10 до 20 кадров в программном обеспечении для микроскопии. Кроме того, установите константы времени блокирующего усилителя на половину времени ожидания пикселя.
Рамановская визуализация различных белковых маркеров и клеток HeLa, зафиксированных параформальдегидом, коры головного мозга мыши и влажной почечной ткани FFPE была выполнена с помощью иммуномаркировки. Иммуно-eprSRS визуализация клеток HeLa с альфа-тубулином выявила тонкие субклеточные структуры, такие как микротрубочки. Визуализация eprSRS окрашенных астроцитов MARS 2145 и окрашенных MARS 2228 мозжечковых гранулированных нейронов в ткани мозга мыши продемонстрировала трехмерные паттерны с субклеточным разрешением.
Выполнена семицветная флуоресцентная тандемная визуализация гормонов и факторов транскрипции на замороженной ткани островка мыши. Полученные снимки показали хороший контраст и правильные узоры. Выполнена восьмицветная флуоресцентная тандемная визуализация SRS маркеров клеточного типа на параформальдегидно-фиксированных тканях мозжечка мыши.
Были идентифицированы различные типы клеток, такие как нейроны мозжечковых гранул, нейроны Пуркинье, астроциты, олигодендроциты и ГАМКергические нейроны. Эта процедура может быть дополнительно объединена с очисткой тканей для выполнения высоко мультиплексированной визуализации белка в толстых неповрежденных тканях. Наша группа разработала протокол очистки тканей, адаптированный к рамановскому красителю.
