Возрастная макулярная дегенерация считается одной из основных причин потери центрального зрения. Прогрессирующая дегенерация и дисфункция слоя РПЭ является отличительной чертой ранней формы ВМД. Несмотря на достижения в области терапии заболеваний сетчатки, разработка эффективного метода лечения остается сложной задачей.
Одной из наиболее перспективных концепций лечения является замена РПЭ культивируемыми in vitro клетками РПЭ различного происхождения. РПЭ обычно доставляются в субретинальное пространство в виде клеточной суспензии, самонесущего клеточного листа или клеточного монослоя, поддерживаемого искусственным носителем. Основное преимущество двух поздних методов заключается в том, что после имплантации клетки находятся в дифференцированном монослойном состоянии в субретинальном пространстве.
Доклинические исследования на животных, проводимые in vivo, направлены на создание воспроизводимой и безопасной хирургической процедуры на модели крупного глазного животного с целью получения данных, которые могут быть полезны и потенциально применимы к людям. С помощью этого протокола мы стремимся сообщить о принципах субретинальной хирургической техники, используемой для субретинальной имплантации in vivo клеточного носителя в модели крупного животного, которая может быть использована для экспериментальных исследований in vivo с имплантацией различных типов клеток и клеточных носителей. Этим видео мы хотели бы представить пошаговый протокол хирургической процедуры субретинальной имплантации клеточного носителя в глаза минипигу Либехова.
Вставьте в крышку зеркало. Вскрывайте конъюнктиву со стороны носа в двух-трех миллиметрах от лимба, чтобы подвергнуть склеру склеротомии. Вставьте три троакара 25-го калибра в трех миллиметрах от лимбуса в область pars plana.
Держите роговицу влажной или покрывайте ее метилцеллюлозой в течение всей операции, чтобы предотвратить осмотический отек роговицы. Удалите среднюю часть стекловидного тела с помощью стандартного трехпортового подхода витрэктомии pars plana. Аккуратно удаляют стекловидное тело за хрусталиком в области будущей большой склеротомии.
Используйте интравитреальную инъекцию ацетонида триамцинолона для окрашивания заднего стекловидного тела, которое обычно остается прилипшим к сетчатке, чтобы выполнить контролируемую заднюю отслойку стекловидного тела. После этого медленно выполняйте субретинальную инъекцию BSS с помощью канюли 41 калибра более централизованно, избегая образования пузырьков по направлению к периферии. Уменьшите внутриглазное давление ирригационной системы до 15 миллиметров ртутного столба во время субретинальной инъекции, чтобы предотвратить преходящую окклюзию сосудов сетчатки.
Выполните линейную большую эндодиатермию сетчатки с помощью эндодиатермического зонда 27 калибра рядом с основанием носового пузыря. После этого сделайте трехмиллиметровую ретинотомию с помощью лезвия MVR 25 калибра или вертикальных ножниц с повышенным внутриглазным давлением, установив систему орошения до 60 миллиметров ртутного столба в течение трех-пяти минут. Затем сделайте трехмиллиметровую склеротомию в трех миллиметрах от лимба с помощью факоножа толщиной 2,75 миллиметра.
Обратите внимание на экзодиатермию возможного кровотечения из склеральных сосудов и цилиарного тела внутрь большой склеротомии. Удалите выпавшее стекловидное тело со стороны большой склеротомии с помощью виректора. Затем аккуратно введите инжектор доминирующей рукой в полость стекловидного тела через большую склеротомию.
Имплантируйте носитель клеток через ретинотомию в субретинальное пространство. Извлеките инжектор из глаза и закройте большую склеротомию с 8-0 Викрильный шов, чтобы избежать осложнений, связанных с внутриглазной гипотонией. Выполните полный жидкостно-воздушный обмен с помощью канюли с силиконовым наконечником.
После этого вводите силиконовое масло в полость стекловидного тела до тех пор, пока внутриглазное давление не станет нормальным. В конце операции удалите троакары и закройте три склеротомии и конъюнктиву с 8-0 Викрильные швы. Для получения дополнительной информации, пожалуйста, ознакомьтесь с разделом «Хирургическая процедура».
Очистите окологлазную область. Используйте щипцы и ножницы, чтобы удалить верхнее и нижнее веко. Удалите третье веко.
Прорежьте конъюнктиву. Разрежьте глазные мышцы ножницами. Продолжайте резку по кругу от поверхности к глубине.
Перережьте зрительный нерв. Удалите глаз с орбиты. Прозрачность полости стекловидного тела, заполненной силиконовым маслом, позволяет визуализировать состояние сетчатки с субретинальным клеточным носителем в любой момент послеоперационного периода.
Изображения без красного цвета показывают, что отражательная способность культивируемых клеток RPE человека в каркасе клеточного носителя не отличается от отражательной способности местного слоя RPE свиньи. ОКТ-визуализация in vivo показывает, что носитель клеток, имплантированный в субретинальное пространство, значительно не увеличивает всю толщину сетчатки. Мембрана Бруха, по-видимому, также остается неповрежденной.
Рамка несущей ячейки вызывает лишь незначительное затенение сигнала OCT. Гистологическое исследование посмертных криосрезов сетчатки демонстрирует формирование сплошного и нерегулярного пигментированного клеточного слоя в области имплантированного первичного РПЭ человека, что доказывает выживаемость культивируемых на клетке клеток-носителей. Иммуногистохимический анализ среза ткани показывает клетки RPE человека, которые присутствуют в области имплантации и экспрессируют типичный маркер RPE, аналогичный нативным клеткам RPE minipig.
Несмотря на это, имплантированные клетки RPE не выглядят как клеточный монослой. Тем не менее, эти клетки расположены в определенном субретинальном пространстве. Модель мини-пигов с большим глазом, в данном случае мини-пиги Либехова, мы считаем одной из наиболее подходящих моделей для будущего применения новых концепций для лечения дегенеративных заболеваний сетчатки из-за их сходства с анатомией и физиологией человеческого глаза.
Это сходство позволяет разрабатывать хирургические методы и инструменты для субретинальной имплантации клеточного носителя, и этот метод может быть легко перенесен на лечение заболеваний глаз человека. Важно обеспечить, чтобы операции на минипигах выполнялись с использованием одних и тех же инструментов, включая инструменты для доставки имплантаций, которые также будут использоваться в операциях на людях, что позволяет без труда применять накопленный опыт и ноу-хау к людям. Подробное описание процедур предоперационного хирургического и послеоперационного ухода может быть полезно для будущих исследований за счет повышения эффективности и стандартизации генерирования данных.
