Die altersbedingte Makuladegeneration gilt als eine der Hauptursachen für den Verlust des zentralen Sehvermögens. Die fortschreitende Degeneration und Funktionsstörung der RPE-Schicht ist ein Kennzeichen der frühen Form der AMD. Trotz Fortschritten in der Therapie von Netzhauterkrankungen bleibt die Entwicklung einer wirksamen Behandlungsmethode eine Herausforderung.
Eines der vielversprechendsten Behandlungskonzepte ist der Ersatz des RPE durch in vitro kultivierte RPE-Zellen unterschiedlicher Herkunft. Die RPE wurden in der Regel in Form einer Zellsuspension, des selbsttragenden Zellblatts oder einer Zellmonoschicht, die von einem künstlichen Träger getragen wird, in den subretinalen Raum eingebracht. Der Hauptvorteil der beiden späten Methoden besteht darin, dass sich die Zellen nach der Implantation in einem differenzierten Monolayer-Zustand im subretinalen Raum befinden.
Präklinische Tierstudien, die in vivo durchgeführt werden, zielen darauf ab, ein reproduzierbares und sicheres chirurgisches Verfahren an einem Tiermodell mit großen Augen zu etablieren, um Daten zu erhalten, die für den Menschen nützlich und potenziell anwendbar sein könnten. Mit diesem Protokoll wollen wir die Prinzipien der subretinalen Operationstechnik für die subretinale Implantation eines Zellträgers in vivo in einem großen Tiermodell vorstellen, das für experimentelle in vivo-Studien mit Implantation verschiedener Zelltypen und Zellträger verwendet werden könnte. Mit diesem Video möchten wir Ihnen ein Schritt-für-Schritt-Protokoll des chirurgischen Verfahrens der subretinalen Implantation des Zellträgers in den Augen des Libechev-Minischweins vorstellen.
Setzen Sie das Deckelspekulum ein. Öffnen Sie die Bindehaut auf der Nasenseite zwei bis drei Millimeter vom Limbus entfernt, um die Sklera für Sklerotomien freizulegen. Setzen Sie die drei 25-Gauge-Trokare drei Millimeter von Limbus im Bereich der Pars plana ein.
Halten Sie die Hornhaut feucht oder beschichten Sie sie während der gesamten Operation mit Methylcellulose, um osmotische Hornhautödeme zu vermeiden. Entfernen Sie den mittleren Teil des Glaskörpers mit dem standardmäßigen Pars-Plana-Vitrektomieansatz mit drei Anschlüssen. Entfernen Sie vorsichtig den Glaskörper hinter der Linse im Bereich der zukünftigen großen Sklerotomie.
Verwenden Sie die intravitreale Triamcinolonacetonid-Injektion zur Färbung des hinteren Glaskörpers, der normalerweise an der Netzhaut haftet, um eine kontrollierte hintere Glaskörperablösung durchzuführen. Führen Sie danach langsam eine subretinale Injektion von BSS mit einer 41-Gauge-Kanüle mittiger durch, um die Bildung der Blase in Richtung Peripherie zu vermeiden. Reduzieren Sie den Augeninnendruck des Spülsystems während der subretinalen Injektion auf 15 Millimeter Quecksilbersäule, um einen vorübergehenden retinalen Gefäßverschluss zu verhindern.
Führen Sie eine lineare große Endodiathermie der Netzhaut mit der 27-Gauge-Endodiathermie-Sonde in der Nähe der Nasenblasenbasis durch. Führen Sie anschließend eine drei Millimeter große Retinotomie mit einer 25-Gauge-MVR-Klinge oder einer vertikalen Schere mit erhöhtem Augeninnendruck durch, die das Spülsystem für drei bis fünf Minuten auf bis zu 60 Millimeter Quecksilber einstellt. Machen Sie dann mit einem 2,75 Millimeter großen Phakomesser eine drei Millimeter große Sklerotomie drei Millimeter vom Limbus entfernt.
Achten Sie auf die Exodiathermie möglicher Blutungen der Skleragefäße und des Ziliarkörpers innerhalb der großen Sklerotomie. Entfernen Sie den vorgefallenen Glaskörper auf der Seite der großen Sklerotomie mit dem Vizerektor. Führen Sie dann den Injektor vorsichtig mit dominanter Hand durch die große Sklerotomie in die Glaskörperhöhle ein.
Implantieren Sie den Zellträger durch die Retinotomie in den subretinalen Raum. Ziehen Sie den Injektor aus dem Auge und schließen Sie die große Sklerotomie mit einem 8-0 Vicryl-Nahtmaterial zur Vermeidung von Komplikationen im Zusammenhang mit intraokularer Hypotonie. Führen Sie einen vollständigen Flüssigkeits-Luft-Austausch mit der Silikonkanüle durch.
Danach injizieren Sie das Silikonöl in die Glaskörperhöhle, bis der Augeninnendruck normal ist. Entfernen Sie am Ende der Operation die Trokare und schließen Sie die drei Sklerotomien und die Bindehaut mit 8-0 Vicryl-Nähte. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt Chirurgischer Eingriff.
Reinigen Sie den periokularen Bereich. Verwenden Sie die Pinzette und die Schere, um das obere und untere Augenlid zu entfernen. Entfernen Sie das dritte Augenlid.
Schneide durch die Bindehaut. Schneiden Sie die Augenmuskeln mit einer Schere durch. Fahren Sie mit dem Schneiden kreisförmig von der Oberfläche bis zur Tiefe fort.
Durchtrennen Sie den Sehnerv. Entferne das Auge aus der Augenhöhle. Die Klarheit der mit Silikonöl gefüllten Glaskörperhöhle ermöglicht es, den Zustand der Netzhaut mit subretinalem Zellträger zu jedem Zeitpunkt der postoperativen Phase sichtbar zu machen.
Die rotfreien Bilder zeigen, dass sich das Reflexionsvermögen der kultivierten humanen RPE-Zellen innerhalb des Zellträgerrahmens nicht von dem Reflexionsvermögen der einheimischen porcinen RPE-Schicht unterscheidet. Die In-vivo-OCT-Bildgebung zeigt, dass der in den subretinalen Raum implantierte Zellträger die gesamte Netzhautdicke nicht signifikant erhöht. Auch die Bruchsche Membran scheint unbeschädigt zu bleiben.
Der Rahmen des Zellträgers verursacht nur eine geringe Abschattung des OCT-Signals. Die histologische Untersuchung von postmortalen Kryoschnitten der Netzhaut zeigt die Bildung der kontinuierlichen und unregelmäßig pigmentierten Zellschicht im Bereich des implantierten primären humanen RPE, was das Überleben der auf den Zellträgern kultivierten Zellen beweist. Die immunhistochemische Analyse des Gewebeschnittes zeigt die humanen RPE-Zellen, die im Bereich der Implantation vorhanden sind und den typischen RPE-Marker ähnlich den einheimischen Minischwein-RPE-Zellen exprimieren.
Trotzdem erscheinen die implantierten RPE-Zellen nicht als Zellmonoschicht. Dennoch befinden sich diese Zellen innerhalb des definierten subretinalen Raums. Ein Großaugen-Tiermodell von Minischweinen, in diesem Fall Libechev-Minischweine, halten wir aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit der Anatomie und Physiologie des menschlichen Auges für eines der am besten geeigneten Modelle für die zukünftige Anwendung neuartiger Konzepte zur Behandlung degenerativer Netzhauterkrankungen.
Diese Ähnlichkeiten ermöglichen es, die chirurgischen Techniken und Instrumente für die subretinale Implantation von Zellträgern zu entwickeln, und diese Technik könnte leicht auf die Behandlung menschlicher Augenerkrankungen übertragen werden. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Operationen an Minischweinen mit den gleichen Instrumenten durchgeführt werden, einschließlich der Werkzeuge zur Verabreichung von Implantationen, die auch in Humanoperationen verwendet werden, so dass die Anwendung der gewonnenen Erfahrungen und des Know-hows auf den Menschen problemlos möglich ist. Die detaillierte Beschreibung der präoperativen und postoperativen Versorgungsabläufe könnte für zukünftige Studien hilfreich sein, indem sie die effiziente und standardisierte Datengenerierung erhöht.
