Мы внедряем метод установления органоидной культуры эпителия дыхательных путей человека в культуральных пластинах. Мы получаем органоид легких человека непосредственно из первичных легочных тканей с высокой эффективностью. Производные органоиды легких человека стабильно расширяются в течение более одного года, а протокол проксимальной дифференцировки позволяет генерировать зрелые органоиды дыхательных путей, которые могут точно имитировать эпителий дыхательных путей человека до почти физиологического уровня.
Поэтому система культивирования позволяет ученым реконструировать и расширить эпителий дыхательных путей человека в культуральных пластинах. Продемонстрировать процедуру будут Ман Чунь Чиу и Ифэй Ю, аспиранты нашей лаборатории Чтобы начать выделение клеток из легочных тканей человека для 3D органоидной культуры, измельчите легочные ткани на одномиллиметровые мелкие кусочки стерильным скальпелем и промыте кусочки ткани 10 миллилитрами холодной базальной среды. Центрифугируйте ткани в 400 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия и выбросьте супернатант перед повторным использованием гранулы в восьми миллилитрах базальной среды, дополненной коллагеназой в конечной концентрации двух миллиграммов на миллилитр.
Затем переварите кусочки ткани, встряхнув трубку при 120 оборотах в минуту в течение 30-40 минут при 37 градусах Цельсия. После пищеварения пипетка вверх и вниз 20 раз, используя 10-миллилитровую серологическую пипетку, чтобы срезать переваренные кусочки ткани. Затем отфильтруйте суспензию с помощью 100-микронного ситечка в 50-миллилитровую трубку.
Извлеките и перенесите кусочки ткани из ситечка в 15-миллилитровую центрифужную трубку с базальной средой. Чтобы прекратить пищеварение, добавляют фетальную бычью сыворотку к проточной до конечной концентрации 2%Затем центрифугируют трубку и повторно суспендируют клеточную гранулу в 10 миллилитрах базальной среды, как описано выше. После центрифугирования повторно суспендируют гранулу в 80-160 микролитрах холодной подвальной матричной среды и помещают трубки на лед.
Затем дозируйте 40 микролитров суспензии в каждую лунку предварительно прогретой 24-луночной суспензионной культуральной пластины. Инкубируйте пластину при температуре 37 градусов Цельсия в течение 10-15 минут. Дайте фундаментной матрице затвердеть и образовать каплю.
После инкубации добавляют в каждую лунку 500 микролитров среды расширения органоидов легких человека, дополненной пятинаномуляром херегулина-бета-1, и инкубируют пластинку в инкубаторе клеточной культуры. Через три дня удалите старую среду, сохранив каплю неповрежденной, и осторожно добавьте свежую среду. После 10-14 дней прохождения наблюдайте за органоидами под микроскопом и убедитесь, что органоиды не встроены с очень высокой плотностью клеток.
Чтобы пройти органоиды легких с помощью сдвига, разбейте капли, пипетируя вверх и вниз одномиллилитровым наконечником. Затем перенесите органоиды вместе со средой в 15-миллилитровую центрифужную трубку и отрегулируйте объем до 10 миллилитров с помощью холодной базальной среды. Центрифугируйте трубку в 300 раз G в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия, выбросьте супернатант и промыте органоиды 10 миллилитрами холодной базальной среды.
Затем повторно суспендируют органоиды в двух миллилитрах холодной базальной среды и разрежут на мелкие кусочки пипеткой Пастера. Затем добавьте базальную среду к общему объему 10 миллилитров и центрифугу перед повторным использованием фрагментов органоидов с холодной фундаментной матрицей, достаточной для обеспечения расширения от 1:3 до 1:5 и размещения трубок на льду. Дозируйте 40 микролитров органоидной суспензии в каждую лунку предварительно нагретой 24-луночной пластины для инкубации при температуре 37 градусов Цельсия, чтобы позволить фундаментной матрице затвердеть в течение 10-15 минут.
Позже добавьте 500 микролитров легочной органоидной расширительной среды к каждой лунке и инкубируйте в инкубаторе клеточной культуры. Обновляйте среду каждые три дня и проходите органоиды каждые две недели. Для прохождения легочных органоидов с трипсинизацией повторно суспендируют извлеченные органоиды легких в одном миллилитре фермента диссоциации.
Высиживайте органоид на водяной бане с температурой 37 градусов Цельсия в течение трех-пяти минут. Затем добавьте один миллилитр базальной среды в трубку и механически отрежьте органоиды путем пипетки вверх и вниз. Проверьте размер органоидных кусочков под микроскопом при 100-кратном увеличении, прежде чем прекратить пищеварение 40 микролитрами фетальной бычьей сыворотки.
Составляют объем до 10 миллилитров с базальной средой и центрифугой перед повторным использованием органоидных кусков в холодную фундаментную матрицу с объемом, достаточным для прохождения с соотношением от 1:5 до 1:10. Затем дозируйте 40 микролитров органоидной суспензии в каждую лунку 24-луночной пластины и культивируйте пластину, как было показано ранее. Чтобы генерировать органоиды 3D-дыхательных путей, инкубируйте органоиды легких в среде расширения в течение семи-10 дней после прохождения с помощью механической резки.
Затем замените расширительную среду проксимальной дифференцировкой и инкубируйте органоиды в инкубаторе клеточной культуры. Через 14 дней отбросьте среду в каждой лунке и добавьте буфер лизата клеток для сбора дифференцированного органоида дыхательных путей для экстракции РНК и обнаружения экспрессии клеточных генов с помощью анализа RT-qPCR. Предварительно инкубируют вставки в инкубаторе клеточной культуры с 250 и 500 микролитрами базальной среды в верхней и нижней камере 24-луночной пластины соответственно.
Затем добавьте один миллилитр базальной среды в трубку и пипетку вверх и вниз, чтобы срезать органоиды в отдельные клетки. Понаблюдайте за клетками под микроскопом перед прекращением пищеварения 40 микролитрами фетальной бычьей сыворотки. Отфильтруйте ячейки через 40-микронный сетчатый фильтр в 50-миллилитровую трубку и перенесите отфильтрованную клеточную суспензию в 15-миллилитровую трубку.
Долить суспензию базальной средой общим объемом 10 миллилитров. После центрифугирования повторно суспендируют гранулу, собранную из 24 капель в 1-2,5 миллилитрах легочной органоидной расширительной среды, в зависимости от плотности клеток. Подсчитайте количество клеток с помощью счетчика клеток под микроскопом, затем отрегулируйте концентрацию клеток до 1,3 раз 10 до шести на миллилитр для 24-луночных вставок.
Удалите базальную среду из верхней и нижней камер перед добавлением 500 микролитров расширительной среды в нижнюю камеру. Посейте 100 микролитров клеточной суспензии, приготовленной ранее, на апикальную камеру 24-луночной вставки и инкубируют. Через два дня замените расширительную среду проксимальной дифференцировочной средой как в апикальной, так и в нижней камере пластины.
Инкубируйте органоиды в течение 14 дней и обновляйте среду каждые три дня. Измеряйте трансэпителиальное электрическое сопротивление каждый день, используя систему измерения электрического сопротивления. На репрезентативной микрофотографии свежеизолированные клетки легких можно увидеть встроенными в матрицу базальной мембраны второго типа с пониженным фактором роста.
Кистозные органоиды появлялись и выращивались с течением времени. Здесь демонстрируются леговидные органоиды после четвертого прохода. В течение двух часов механической резки органоидные фрагменты, встроенные в экстракт базальной мембраны, образовывали кистозные домены.
Микрофотография того же поля на пятый день подтвердила рост органоидов с течением времени. Расширяющиеся органоиды содержали все четыре основных типа эпителиальных клеток дыхательных путей, включая ACCTUB-положительную или FOXJ1-положительную реснитчатую клетку, P63-положительную базальную клетку, CC10-положительную клубную клетку и MUC5AC-положительную бокаловидную клетку в преждевременном состоянии. Органоиды, инкубированные в среде расширения и проксимальной дифференцировки, со временем развили отчетливую морфологию.
После двух недель дифференцировки в проксимальной среде дифференцировки подвижные реснички были различимы в каждом органоиде. Было замечено, что синхронно бьющаяся селия загоняла обломки клеток внутрь просвета органоида и закручивала их в однонаправленном направлении, чтобы удалить вдыхаемые частицы. Кроме того, анализ проточной цитометрии показал, что дифференцированные органоиды вмещали четыре типа эпителиальных клеток дыхательных путей в проксимальной дифференцировке и расширительной среде.
После двух недель дифференцировки органоиды 2D дыхательных путей развили неповрежденный эпителиальный барьер. Был проведен анализ закупорки декстрана для оценки целостности эпителиального барьера, образованного в 2D органоидах дыхательных путей. 2D-органоиды содержали обильные реснитчатые клетки.
Долгосрочный расширяемый органоид легких и дифференцированный органоид дыхательных путей обеспечивают физиологически активную и универсальную модельную систему для изучения респираторной биологии и патологии, включая COVID-19.
