Понимание того, как развиваются астроциты и устанавливают их сложную морфологию, имеет важное значение для понимания того, как мозг развивается и функционирует. Этот протокол описывает, как анализировать ключевые аспекты морфологии астроцитов в ткани мозга. Этот протокол использует пользовательский код для измерения объема территории астроцитов в толстых участках ткани.
Эта стратегия также может быть применена для измерения количества перекрытия территории между соседними астроцитами. Комбинируя этот протокол с генетическими манипуляциями с астроцитами, исследователи могут непосредственно исследовать роль специфических белков и путей в развитии астроцитов и взаимодействии астроцитов с астроцитами Для начала приготовьте свежий раствор TBST, добавив 1 миллилитр 10% Triton X в 50-миллилитровую трубку и заполнив трубку до 50 миллилитров с TBS. Подготовьте 2 миллилитра блокирующих и антителовых растворов для каждого мозга, объединив козью сыворотку и TBST в TBS. Подготовьте 2 миллилитра блокирующих и антителовых растворов для каждого мозга, объединив козью сыворотку и TBST в 15-миллилитровая трубка.
Затем маркируйте 24-луночную пластину для размещения различных образцов в разных рядах в разных растворах в разных столбцах, затем добавьте один миллилитр TBST в первые три столбца, помеченные как wash 1, wash 2 и wash 3, и добавьте 1 миллилитр блокирующего раствора в четвертую колонку. Подготовьте стеклянную кирку, расплавив конец 5,75-дюймовой пипетки Пастера в небольшой крючок с помощью горелки Бунзена, затем переместите участки ткани из 12-луночной пластины в промывку 1 колонны 24-луночной пластины с помощью кирки, затем промыть секции в течение 10 минут каждый в промывке 1, 2, и 3 скважины с помощью стеклянной кирки для переноса секций из одной скважины в другую с последующим инкубированием секций в течение одного часа в блокирующем растворе. Готовят q миллилитра раствора первичного антитела, добавляя антитело к раствору антитела, затем кратковременно вихрь и центрифугируют в течение 5 минут при большем или равном 4 000 г при 4 градусах Цельсия.
Затем инкубируют срезы в первичных антителах в течение 2-3 ночей при 4 градусах Цельсия при встряхивании. После первичной инкубации антител аспирировать 1-й день TBST из промывочных колодцев, затем добавить 1 миллилитр нового TBST в каждую промывочную скважину и переместить секции в первый промывочный колодец. Далее инкубируют срезы во вторичных антителах в течение 3 часов при комнатной температуре.
После вторичной инкубации антител аспирируют день-2 TBST из промывочных колодцев, затем добавляют 1 миллилитр нового TBST в каждую промывочную скважину и перемещают секции в первый промывочный колодец. Во время окончательной промывки выньте монтажную среду от 4 градусов Цельсия и дайте ей нагреться до комнатной температуры, затем приготовьте смесь TBS и деионизированной воды 2 к 1 и добавьте ее в чашку Петри. Затем подготовьте слайд микроскопа, добавив на поверхность 800 микролитров смеси TBS и деионизированной воды 2 к 1.
Переложите секции из промывки 3 колодца в чашку Петри, затем с помощью тонкой кисти переложите секции по одному из чашки Петри в жидкость на слайде. Далее аккуратно расположите участки так, чтобы они были плоскими на слайде с помощью кисти. Осторожно удалите лишнюю жидкость с горки пипеткой P-1000 с последующей вакуум-аспирацией.
После того, как вся лишняя жидкость будет удалена с слайда, используйте передаточную пипетку, чтобы немедленно добавить 1 каплю монтажного материала в каждую секцию и аккуратно положить крышку на слайд. Дайте монтажному материалу растекаться в течение нескольких минут, а затем удалите все лишние монтажные материалы, которые выходят из-под крышки с помощью вакуум-аспирации. После этого запечатайте все четыре края крышки прозрачным лаком для ногтей.
Дайте слайдам высохнуть в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем храните их при температуре 4 градуса Цельсия. Используя 10-кратный объектив, найдите отдельные клетки для визуализации и запишите конкретную область мозга или субрегион, относящийся к эксперименту, а затем, используя ручку фокусировки, определите, содержится ли весь астроцит в секции. После этого переключитесь на масляный объектив с более высоким увеличением и сосредоточьте ячейку.
Глядя через окуляр, используйте ручку фокусировки, чтобы переместиться сверху вниз ячейки, а затем визуально осмотрите ячейку, чтобы убедиться, что вся ячейка содержится в секции. Используя конфокальные микроскопы, связанные с программным обеспечением для сбора, настройте параметры сбора для получения соответствующего отношения сигнал/шум и уровня детализации, затем используйте 2-кратный зум для 40-кратного объектива и без зума при использовании 60-кратного или 63-кратного объектива. Установите верхнюю и нижнюю границы Z-стека с размером шага 0,5 микрометра, гарантируя, что весь астроцит захватывается с первым и последним изображениями без какой-либо флуоресцентной маркировки клетки.
Перед началом анализа установите файл расширения выпуклого корпуса, XtspotsConvexHull, вставив файл в подпапку rtmatlab папки XT. Используя конвертер файлов Imaris, конвертируйте изображения в формат IMS. Затем откройте файл изображения в программном обеспечении для анализа изображений и нажмите кнопку 3D View, чтобы просмотреть изображение в режиме 3D, убедившись, что ячейка соответствует критериям включения.
Чтобы создать поверхность, щелкните синий значок «Добавить новые поверхности», затем создайте интересующую область вокруг ячейки, введя размеры в поля под размером инструмента создания поверхности или перетащив края желтого поля. Затем отрегулируйте пороговую абсолютную интенсивность, перетащив желтую полосу или введя значения в поле, чтобы серая поверхность заполняла как можно больше сигнала ячейки, не выходя за границу ячейки. После этого нажмите на зеленую стрелку, чтобы завершить генерацию поверхности.
Внимательно осмотрите вновь созданную поверхность и удалите все части поверхности, которые не являются частью ячейки, выделив их, а затем щелкнув инструмент «Редактирование карандаша», а затем параметр «Удалить». Чтобы унифицировать оставшиеся части поверхности, нажмите на значок фильтра воронки, чтобы выбрать все, затем нажмите на значок «Редактирование карандаша» и выберите опцию «Унифицировать». Нажмите на оранжевый значок «Добавить новые пятна» и выберите правильный исходный канал из раскрывающегося списка, а затем введите в поле приблизительное значение диаметра XY 0,400 микрометра.
Затем нажмите на зеленую стрелку, чтобы завершить создание пятен, затем повторно выберите пятна. Щелкните значок Фильтр и выберите Кратчайшее расстояние до поверхностей Поверхности X, где поверхности X — это поверхность, анализируемая из раскрывающегося списка, гарантируя, что кнопки питания нижнего и верхнего порога выделены зеленым цветом. Затем введите минимальное расстояние минус 1,0 микрометра в нижнем пороговом поле и максимальное расстояние 0,1 микрометра в верхнем пороговом поле, затем нажмите кнопку Дублировать секцию в новые места, убедившись, что вновь созданные пятна выбраны в верхней левой панели окна программного обеспечения.
После этого нажмите на значок Gear Tools, а затем нажмите на плагин Convex Hull только один раз и подождите, пока появится окно MATLAB, а затем исчезнет, что приведет к прочному корпусу в 3D-виде. В верхней левой панели убедитесь, что выбран выпуклый корпус Spots X Selection, Кратчайшее расстояние, где Spots X Selection является вновь созданными пятнами, а затем нажмите на корпус, чтобы выбрать его. Затем нажмите на значок Статистика графика.
На вкладке Выбор убедитесь, что в верхнем раскрывающемся списке выбран параметр Конкретные значения, а затем выберите Том из нижнего раскрывающегося списка, затем запишите объем корпуса и сохраните файл, перейдя к следующему изображению. Объем территории астроцитов измеряли в астроцитах, экспрессирующих мембранно-целевой красный флуоресцентный белок. Нокдаун молекулы клеточной адгезии, обогащенной астроцитами, гепаКАМ, значительно уменьшает объем территории астроцитов.
Мозаичный анализ с двойными маркерами использовался для генерации мышей, где астроциты дикого типа экспрессируют красный флуоресцентный белок, а нокаутирующие астроциты hepaCam экспрессируют зеленый флуоресцентный белок. Рассчитан процент перекрытия территории между соседними парами красных и зеленых флуоресцентных белков астроцитов. Мыши с генетической модификацией гепаКАМ и зеленых астроцитов показали значительно увеличенный процент перекрытия территории с их красными соседями дикого типа по сравнению с парами астроцитов только дикого типа.
Этот результат демонстрирует, что гепаКАМ необходим для нормального объема территории астроцитов и астроцитарной плитки. Крайне важно убедиться, что ячейка соответствует критериям включения. Неполная ячейка будет иметь меньший объем территории и может повлиять на ваши общие результаты и выводы.
