성상세포가 어떻게 복잡한 형태를 개발하고 확립하는지 이해하는 것은 뇌가 어떻게 발달하고 기능하는지 이해하는 데 필수적입니다. 이 프로토콜은 뇌 조직에서 성상 세포 형태학의 주요 측면을 분석하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 사용자 정의 코드를 사용하여 두꺼운 조직 섹션에서 성상 세포 영역 부피를 측정합니다.
이 전략은 또한 이웃 성상세포들 사이의 영토 중첩의 양을 측정하기 위해 적용될 수 있다. 이 프로토콜을 성상 세포의 유전 적 조작과 결합함으로써 연구자들은 성상 세포 발달 및 성상 세포 - 성상 세포 상호 작용에서 특정 단백질 및 경로의 역할을 직접 조사 할 수 있습니다 시작하기 위해 50 밀리리터 튜브에 10 % Triton X 1 밀리리터를 추가하고 TBS로 튜브를 50 밀리리터로 채우는 TBST의 신선한 용액을 준비하십시오. 염소 혈청과 TBST를 결합하여 각 뇌에 대해 2 밀리리터의 차단 및 항체 용액을 준비하십시오. 15밀리리터 튜브.
그런 다음 24웰 플레이트에 라벨을 붙여서 서로 다른 컬럼의 서로 다른 용액의 서로 다른 행에 서로 다른 샘플을 배치한 다음 세척 1, 세척 2, 세척 3으로 표시된 처음 세 열에 TBST를 1밀리리터 추가하고 네 번째 컬럼에 블로킹 용액 1밀리리터를 추가합니다. 분젠 버너를 이용하여 작은 후크에 5.75인치 파스퇴르 피펫의 끝을 녹여 유리 픽을 준비한 다음, 12웰 플레이트로부터 조직 절편을 픽을 이용하여 24웰 플레이트의 세척 1열로 옮긴 다음, 1, 2로 각각 10분간 절편을 세척하고, 3개의 웰을 유리 픽을 사용하여 한 웰에서 다음 웰로 절편을 옮기고, 이어서 블로킹 용액에서 한 시간 동안 절편을 인큐베이션하였다. 항체를 항체 용액에 첨가하여 일차 항체 용액의 q 밀리리터를 준비한 다음, 섭씨 4도에서 4, 000배 g보다 크거나 같은 곳에서 5분 동안 간단히 와류하고 원심분리한다.
다음에, 일차 항체의 절편을 진탕하면서 섭씨 4도에서 2 내지 3박 동안 인큐베이션한다. 1차 항체 인큐베이션 후, 세척 웰로부터 1일-1 TBST를 흡인한 다음, 각 세척 웰에 1 밀리리터의 새로운 TBST를 첨가하고, 절편을 첫 번째 세척 웰로 옮긴다. 다음에, 절편을 실온에서 3시간 동안 이차 항체로 인큐베이션한다.
2차 항체 인큐베이션 후, 세척 웰로부터 2 TBST를 흡인한 다음, 각 세척 웰에 1 밀리리터의 새로운 TBST를 첨가하고, 절편을 첫 번째 세척 웰로 이동시킨다. 최종 세척 중에 장착 매체를 섭씨 4도에서 꺼내 실온으로 따뜻하게 한 다음 TBS와 탈 이온수의 2 대 1 혼합물을 준비하고 페트리 접시에 첨가하십시오. 다음으로, 표면에 TBS와 탈이온수의 2-to-1 혼합물 800 마이크로리터를 첨가하여 현미경 슬라이드를 제조하였다.
세척 3 웰에서 페트리 접시로 섹션을 옮긴 다음 미세한 페인트 브러시를 사용하여 섹션을 페트리 접시에서 슬라이드의 액체로 한 번에 하나씩 옮깁니다. 그런 다음 페인트 브러시를 사용하여 슬라이드에서 평평하도록 섹션을 조심스럽게 정렬하십시오. 조심스럽게 P-1000 피펫으로 슬라이드에서 과도한 액체를 제거한 다음 진공 흡인하십시오.
슬라이드에서 여분의 액체가 모두 제거되면 전사 피펫을 사용하여 각 섹션에 장착 매체 1 방울을 즉시 추가하고 슬라이드 위에 덮개 슬립을 부드럽게 놓습니다. 장착 매체를 몇 분 동안 퍼뜨린 다음 진공 흡인으로 커버 슬립 아래에서 나오는 과도한 장착 매체를 제거하십시오. 그런 다음 커버 슬립의 네 가장자리를 모두 투명한 매니큐어로 밀봉하십시오.
슬라이드를 실온에서 30 분 동안 건조시킨 다음 섭씨 4도에서 평평하게 보관하십시오. 10x 목표를 사용하여 이미징을 위해 개별 세포를 찾고 실험과 관련된 특정 뇌 영역 또는 하위 영역을 기록한 다음 초점 노브를 사용하여 전체 성상 세포가 섹션 내에 포함되어 있는지 여부를 결정합니다. 그 후, 더 높은 배율 오일 목표로 전환하고 세포에 초점을 맞 춥니 다.
아이피스를 들여다보면서 포커스 노브를 사용하여 셀의 위쪽에서 아래쪽으로 이동한 다음 세포를 육안으로 검사하여 전체 셀이 섹션 내에 포함되어 있는지 확인합니다. 공초점 현미경과 관련된 수집 소프트웨어를 사용하여 수집 매개 변수를 조정하여 적절한 신호 대 잡음비 및 세부 수준을 얻은 다음 60x 또는 63x 목표를 사용하는 경우 40x 목표에 대해 2x 줌을 사용하고 줌을 사용하지 않습니다. Z-스택의 위쪽 및 아래쪽 경계를 0.5마이크로미터의 스텝 크기로 설정하여 전체 성상세포가 세포의 형광 표지 없이 첫 번째 및 마지막 이미지로 캡처되도록 합니다.
분석을 시작하기 전에 XT 폴더의 rtmatlab 하위 폴더에 파일을 붙여 넣어 볼록한 선체 확장 파일인 XtspotsConvexHull을 설치합니다. Imaris 파일 변환기를 사용하여 이미지를 IMS 형식으로 변환하십시오. 그런 다음 이미지 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 열고 3D 뷰 버튼을 선택하여 3D 모드에서 이미지를 보고 셀이 포함 기준을 충족하는지 확인합니다.
서피스를 생성하려면 파란색 새 서피스 추가 아이콘을 클릭한 다음 서피스 생성 도구 크기 아래의 상자에 치수를 입력하거나 노란색 상자의 모서리를 드래그하여 셀 주위에 관심 영역을 만듭니다. 그런 다음 노란색 막대를 드래그하거나 상자에 값을 입력하여 회색 표면이 셀 경계를 넘지 않고 가능한 한 많은 셀 신호를 채우도록 하여 임계값 절대 강도를 조정합니다. 그런 다음 녹색 화살표를 클릭하여 서피스 생성을 마칩니다.
새로 생성된 서피스를 주의 깊게 검사하고 셀에 속하지 않는 서피스 조각을 선택한 다음 연필 편집 도구를 클릭한 다음 삭제 옵션을 클릭하여 삭제합니다. 나머지 서피스 조각을 통합하려면 깔때기 필터 아이콘을 클릭하여 모두 선택한 다음 연필 편집 아이콘을 클릭하고 통합 옵션을 선택합니다. 주황색 새 스팟 추가 아이콘을 클릭하고 드롭다운 목록에서 올바른 소스 채널을 선택한 다음 상자에 0.400마이크로미터의 예상 XY 직경 값을 입력합니다.
그런 다음 녹색 화살표를 클릭하여 점 만들기를 마친 다음 점을 다시 선택하십시오. 필터 아이콘을 클릭하고 서피스 서피스 X까지의 최단 거리를 선택합니다. 여기서 서피스 X는 드롭다운 목록에서 분석 중인 서피스이며, 임계값 하한과 상위 임계값 전원 버튼이 모두 녹색인지 확인합니다. 그런 다음 아래쪽 임계값 상자에 영하 1.0마이크로미터의 최소 거리와 위쪽 임계값 상자에 0.1마이크로미터의 최대 거리를 입력한 다음 새 스팟에 섹션 복제 단추를 클릭하여 새로 생성된 스폿이 소프트웨어 창의 왼쪽 위 패널에서 선택되도록 합니다.
그런 다음 기어 도구 아이콘을 클릭 한 다음 볼록한 헐 플러그인을 한 번만 클릭하고 MATLAB 창이 나타날 때까지 기다렸다가 사라지면 3D 뷰에서 단단한 선체가 생깁니다. 왼쪽 위 패널에서 스팟 X 선택의 볼록한 선체, 스팟 X 셀렉션이 새로 생성된 스팟인 최단 거리가 선택되었는지 확인한 다음 선체를 클릭하여 선택합니다. 그런 다음 그래프 통계 아이콘을 클릭하십시오.
선택 탭의 위쪽 드롭다운 목록에서 특정 값이 선택되었는지 확인한 다음 아래쪽 드롭다운 목록에서 볼륨을 선택한 다음 선체의 볼륨을 기록하고 파일을 저장하여 다음 이미지로 진행합니다. 성상세포 영역 부피는 막 표적화된 적색 형광 단백질을 발현하는 성상세포에서 측정되었다. 성상세포 풍부 세포 부착 분자인 hepaCAM의 녹다운은 성상세포 영역 부피를 상당히 감소시킨다.
이중 마커를 사용한 모자이크 분석은 야생형 성상세포가 적색 형광 단백질을 발현하고 간암 녹아웃 성상세포가 녹색 형광 단백질을 발현하는 마우스를 생성하는데 사용되었다. 이웃하는 적색 및 녹색 형광 단백질 성상세포 쌍 사이의 영역 중첩의 백분율을 계산하였다. 간암 및 녹색 성상세포의 유전자 변형을 가진 마우스는 야생형 전용 성상세포 쌍에 비해 적색 야생형 이웃과 영토 중첩 부피의 상당히 증가된 비율을 보였다.
이 결과는 간암이 정상적인 성상세포 영역 부피 및 성상세포 타일링에 필요하다는 것을 입증한다. 세포가 포함 기준을 충족하는지 확인하는 것이 중요합니다. 불완전한 셀은 더 작은 영토 부피를 가지며 전반적인 결과와 결론에 영향을 줄 수 있습니다.
