アストロサイトがどのように発達し、その複雑な形態を確立するかを理解することは、脳がどのように発達し機能するかを理解するために不可欠です。このプロトコルは、脳組織におけるアストロサイト形態の重要な側面を分析する方法を記述している。このプロトコルは、カスタムコードを使用して、厚い組織切片のアストロサイト領域体積を測定します。
この戦略は、隣接するアストロサイト間の領域重複の量を測定するためにも適用することができる。このプロトコルをアストロサイトの遺伝子操作と組み合わせることで、研究者はアストロサイトの発生とアストロサイト-アストロサイト相互作用における特定のタンパク質と経路の役割を直接調査することができます まず、1ミリリットルの10%Triton Xを50ミリリットルのチューブに添加し、チューブをTBSで50ミリリットルに充填することによって、TBSTの新鮮な溶液を調製します。 ヤギ血清とTBSTを組み合わせて、各脳に2ミリリットルのブロッキングおよび抗体溶液を調製する。15ミリリットルのチューブ。
次に、24ウェルプレートにラベルを付け、異なるカラムの異なる溶液に異なるサンプルを異なる列に配置し、洗浄1、洗浄2、および洗浄3とラベル付けされた最初の3つの列に1ミリリットルのTBSTを加え、4番目のカラムに1ミリリットルのブロッキング溶液を加えます。5.75インチパスツールピペットの端部をブンゼンバーナーを使用して小さなフックに溶かしてガラスピックを作製し、次いで、組織切片を12ウェルプレートからピックを用いて24ウェルプレートの洗浄1カラムに移し、次いで、洗浄1、2で切片をそれぞれ10分間洗浄し、 ガラスピックを用いて3つのウェルを1つのウェルから次のウェルに切片を移し、続いて切片をブロッキング溶液中で1時間インキュベートした。抗体溶液に抗体を添加してqミリリットルの一次抗体溶液を調製し、次いで、4°Cで4,000倍g以上で5分間遠心分離して短時間ボルテックスする。
次に、切片を一次抗体中で、振とうしながら摂氏4度で2〜3晩インキュベートする。一次抗体インキュベーション後、洗浄ウェルから1日目TBSTを吸引し、各洗浄ウェルに1ミリリットルの新しいTBSTを加え、切片を最初の洗浄ウェルに移動します。次に、切片を二次抗体中で室温で3時間インキュベートする。
二次抗体インキュベーション後、洗浄ウェルから2日目TBSTを吸引し、各洗浄ウェルに1ミリリットルの新しいTBSTを加え、切片を最初の洗浄ウェルに移動します。最終洗浄中は、マウント媒体を摂氏4度から取り出して室温まで温め、TBSと脱イオン水の2対1の混合物を調製し、ペトリ皿に加えます。次に、表面にTBSと脱イオン水の2対1混合物を800マイクロリットル加えて顕微鏡スライドを作製した。
洗浄3ウェルから切片をシャーレに移し、次いで細かい絵筆を用いて、シャーレからスライド上の液体に切片を1枚ずつ移す。次に、ペイントブラシを使用して、スライド上で平らになるようにセクションを慎重に配置します。慎重に、P-1000ピペットでスライドから余分な液体を取り除き、続いて真空吸引します。
余分な液体がスライドからすべて取り除かれたら、トランスファーピペットを使用してすぐに各セクションに1滴の取り付けメディアを追加し、カバースリップをスライドの上に静かに置きます。マウントメディアが数分間広がるのを待ってから、カバースリップの下から出てくる余分なマウントメディアを真空吸引で取り外します。その後、カバースリップの4つの端をすべて透明なマニキュアで密封します。
スライドを室温で30分間乾燥させ、その後4°Cで平らに保管します。10倍の対物レンズを使用して、イメージングのために個々の細胞を見つけ、実験に関連する特定の脳領域またはサブ領域を書き留め、フォーカスノブを使用して、アストロサイト全体がセクション内に含まれるかどうかを判断します。その後、高倍率のオイル対物レンズに切り替えて、セルに焦点を合わせます。
アイピースを覗き込みながら、フォーカスノブを使用してセルの上から下に移動し、セルを目視で検査して、セル全体がセクション内に収まっていることを確認します。共焦点顕微鏡関連の集録ソフトウェアを使用して、集録パラメータを調整して適切な信号対雑音比と詳細レベルを取得し、40倍対物レンズの場合は2倍ズームを使用し、60倍または63倍対物レンズを使用する場合はズームを使用しません。Zスタックの上下の境界を0.5マイクロメートルのステップサイズで設定し、細胞の蛍光標識なしでアストロサイト全体が最初と最後の画像でキャプチャされるようにします。
解析を開始する前に、XT フォルダの rtmatlab サブフォルダにファイルを貼り付けて、凸包拡張ファイル XtspotsConvexHull をインストールします。Imaris ファイル・コンバーターを使用して、イメージを IMS 形式に変換します。次に、画像解析ソフトウェアで画像ファイルを開き、[3D 表示] ボタンを選択して画像を 3D モードで表示し、セルが包含基準を満たしていることを確認します。
サーフェスを作成するには、青色の「新しいサーフェスを追加」(Add New Surfaces) アイコンをクリックし、サーフェス作成ツールのサイズの下にあるボックスに寸法を入力するか、黄色のボックスの端をドラッグして、セルの周囲に関心領域を作成します。次に、黄色のバーをドラッグするか、ボックスに値を入力して、グレーの表面がセルの境界を超えずにできるだけ多くのセル信号を埋めるようにして、しきい値の絶対強度を調整します。その後、緑色の矢印をクリックしてサーフェスの生成を終了します。
新しく生成されたサーフェスを慎重に検査し、セルの一部ではないサーフェスピースを選択して削除し、[鉛筆編集]ツールをクリックしてから[削除]オプションをクリックします。残りのサーフェスピースを統一するには、「ファネルフィルター」アイコンをクリックしてすべてを選択し、「鉛筆編集」アイコンをクリックして「統一」オプションを選択します。オレンジ色の「新規スポットを追加」アイコンをクリックし、ドロップダウンリストから正しいソースチャンネルを選択し、0.400マイクロメートルの推定XY直径値をボックスに入力します。
次に、緑色の矢印をクリックしてスポットの作成を終了し、スポットを再選択します。[フィルタ]アイコンをクリックし、[サーフェス サーフェス X](サーフェス X は解析対象のサーフェス)の[サーフェス X] を選択し、電源ボタンが緑色になっていることを確認します。次に、最小距離からマイナス1.0マイクロメートルを下限ボックスに入力し、最大距離0.1マイクロメートルを上限しきい値ボックスに入力し、[セクションを新しいスポットに複製]ボタンをクリックして、新しく作成したスポットがソフトウェアウィンドウの左上パネルで選択されていることを確認します。
その後、ギアツールアイコンをクリックし、凸ハルプラグインを1回だけクリックし、MATLABウィンドウが表示されるのを待ってから消え、3Dビューで固体船体になります。左上のパネルで、「スポット X 選択の凸船体」、スポット X 選択が「新しく作成されたスポット」である最短距離」が選択されていることを確認し、船体をクリックして選択します。次に、グラフ統計アイコンをクリックします。
[選択] タブで、上部のドロップダウン リストから [特定の値] が選択されていることを確認し、下部のドロップダウン リストから [ボリューム] を選択してから、船体のボリュームを記録してファイルを保存し、次のイメージに進みます。アストロサイト領域体積は、膜標的赤色蛍光タンパク質を発現するアストロサイトにおいて測定した。アストロサイト富化細胞接着分子hepaCAMのノックダウンは、アストロサイト領域体積を有意に減少させる。
二重マーカーを用いたモザイク解析を用いて、野生型アストロサイトが赤色蛍光タンパク質を発現し、hepaCamノックアウトアストロサイトが緑色蛍光タンパク質を発現するマウスを作製した。隣接する赤色および緑色蛍光タンパク質アストロサイト対間の領域重複の割合を計算した。hepaCAMおよび緑色アストロサイトの遺伝子改変を有するマウスは、野生型のみのアストロサイト対と比較して、赤色の野生型隣接体との領域重複体積の割合が有意に増加したことを示した。
この結果は、hepaCAMが正常なアストロサイト領域容積、およびアストロサイトタイリングに必要であることを実証する。セルが包含基準を満たしていることを確認することが重要です。不完全なセルはテリトリーのボリュームが小さくなり、全体的な結果と結論に影響を与える可能性があります。
