Протокол значительно снижает число копий митохондриальной ДНК в ооците. Это может быть полезно для внутривидового клонирования. Этот метод снижает количество копий митохондриальной ДНК в яйцеклетках крупного рогатого скота более чем на 90%, что может снизить частоту митохондриальной гетероплазмы у клонированных эмбрионов.
Лора Адамс, аспирант из моей лаборатории, продемонстрирует процедуру. Для начала, используя пипетку, соберите отобранные зрелые ооциты из капли HSOF и поместите их в 1,5-миллилитровую трубку, содержащую 50 микролитров раствора HSOF CB. Центрифугируйте ооциты в 15 000 раз G в течение 12 минут.
Пока ооциты центрифугируются, подготовьте бисекционную пластину. Для этого начните с изготовления рисунка на крышке 60-миллиметровой чашки Петри, используя 20 микролитров на каплю, и полностью накройте капли минеральным маслом. С помощью маркера с тонким наконечником отметьте линии под блюдом.
Накройте блюдо непрозрачной крышкой до завершения центрифугирования для предотвращения изменения осмолярности микрокапель. Как только центрифугирование будет завершено, используйте 200-микролитровую пипетку, чтобы собрать ооциты внутри раствора, и переместите их в пустую часть новой поисковой пластины с четырьмя каплями HSOF 400 микролитров, прежде чем промывать ооциты через капли HSOF. Включите ступень нагрева до 38,5 градусов по Цельсию.
Используйте ротовую пипетку для перемещения центрифугированных ооцитов от капли HSOF к верхней левой капле T2 бисекционной пластины. Затем промыть ооциты через следующие три капли на верхнем ряду. Депонируйте яйцеклетки в одной из проназных капель, гарантируя, что между ними практически нет контакта.
Наблюдают за ооцитами до тех пор, пока не появится явная деформация zonae pellucidae. Как только один oocyte zona pellucida деформируется, переместите этот ооцит в соседнюю каплю Т2. Повторяйте по мере того, как дополнительные ооциты деформируются, пока все ооциты не будут удалены из проназы и помещены в каплю Т2.
Наблюдайте за ооцитами до тех пор, пока не останется только тонкий слой пеллюцидной зоны. Промыть ооциты через следующие три капли внутри ряда, затем поместить их вертикальными линиями внутри капель CBT20. Начните с меньшего количества ооцитов в вертикальных линиях и увеличивайте количество ооцитов на каплю по мере развития навыков бисекции.
Сосредоточьтесь на первой, самой левой капле CBT20, которая содержит ооциты, и используйте ротовую пипетку для вращения ооцитов так, чтобы плотная митохондриями часть каждого ооцита была либо обращена к руке микроскопа, либо от нее. Положите кончик микробелка слева от самой верхней яйцеклетки, в соответствии с пространством непосредственно над митохондриями -плотной частью. Держа кончик лезвия в том же месте, осторожно опустите лезвие, чтобы разрезать весь путь через ооцит.
Убедитесь, что митохондриально-плотный оопласт и митохондриально-восстановленный оопласт имеют примерно одинаковый размер, а лезвие делится пополам в самом прозрачном сегменте центрифугированного ооцита. При подъеме лезвия убедитесь, что поддерживается та же линия, и что кончик лезвия остается на том же месте, затем осторожно поднимите наконечник с пластины. Повторите этапы бисекции для всех ооцитов в пределах первой капли бисекции.
Если ооциты присутствуют в дополнительных каплях, ориентируйте и разделяйте пополам оставшиеся ооциты. Используя ротовую пипетку, соберите митохондриально-восстановленные оопласты с первой капли бисекции. Поместите их в левую руку T20 капли, расположенной в нижнем ряду пластины.
Повторите для всех оставшихся капель бисекции. Используя ротовую пипетку, соберите плотные оопласты митохондрий с первой капли бисекции. Поместите их в правую руку T20 капли, расположенную в нижнем ряду пластины.
Повторите для всех оставшихся капель бисекции. Извлеките блюдо T10 из четырех лунок из инкубатора. Используя ротовую пипетку, переместите все митохондриально-восстановленные оопласты в хорошо маркированный MR, а митохондриально-плотные оопласты в хорошо маркированный M.Поместите четырехлуночную пластину обратно в инкубатор, контролируемый углекислым газом.
Дайте оопластам отдохнуть не менее 30 минут до количественной оценки мтДНК. Для успешной бисекции образцы из цельных ооцитов и митохондриально-плотных оопластов имеют сходные значения КТ. Образцы из митохондриально-восстановленных оопластов имеют более высокие значения КТ по сравнению с образцами из двух других групп.
Для неудачной бисекции бисекция не снижает содержание мтДНК эффективно в митохондриальных оопластах. После получения стандартной кривой и использования предоставленных формул числа копий мтДНК с использованием этого протокола было достигнуто среднее снижение мтДНК ооцитов на 93,88%. Правильная ориентация каждого ооцита в капле бисекции, точное разделение каждого ооцита пополам и точная сортировка оопластов — все это критические шаги, которые необходимо предпринять для получения успешных результатов.
Два оопласта могут быть слиты с одной соматической клеткой. Затем слитые триплеты могут быть химически активированы и культивированы как реконструированные эмбрионы.
