Quindi, usando questo protocollo, possiamo visualizzare i citonemi nel tessuto di topo fisso in tutto l'embrione con la microscopia ottica standard. Usando questa tecnica, possiamo sondare le proteine di segnalazione endogene che viaggiano lungo i citonemi, piuttosto che fare affidamento su modelli murini geneticamente manipolati che utilizzano proteine marcate fluorescentemente. Durante il tentativo di questo protocollo, è importante maneggiare delicatamente le sezioni di tessuto per la conservazione ottimale dei citonemi.
A dimostrare questa procedura saranno Miriam Dillard, ricercatrice capo del mio gruppo, e Christina Daly, una studentessa laureata di St.Jude. Per iniziare, utilizzare forbici e pinze di dissezione per eseguire un'incisione a Y nella cavità peritoneale. Asportare l'utero contenente E 9,5 embrione.
Sezionare gli embrioni in un mezzo di crescita DMEM completo. Utilizzare una pinza per rimuovere il SAC vitellino, la placenta e le membrane circostanti. Risciacquare gli embrioni isolati in HBSS per rimuovere qualsiasi residuo di tessuto amniotico e sangue.
Quindi, preparare il fissativo aggiungendo paraformaldeide a HBSS per una concentrazione di lavoro del 4% di paraformaldeide. Aggiungere un millilitro di questa soluzione a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Posizionare gli embrioni in singoli pozzetti.
Incubare gli embrioni per 45 minuti con una delicata agitazione su un bilanciere. Dopo l'incubazione, rimuovere il fissativo e lavare gli embrioni tre volte, per 30 minuti in PBS con aggiunta di calcio, magnesio e 0,1% Tritone. Quindi incubare gli embrioni in soluzione bloccante con agitazione delicata due volte, per un'ora ciascuno.
Dopo la seconda incubazione, sciacquare gli embrioni usando una soluzione bloccante fresca. Nel frattempo, preparare la soluzione anticorpale primaria diluendo gli anticorpi in PBS integrato. Al termine del risciacquo, rimuovere la soluzione bloccante e aggiungere un millilitro di soluzione anticorpale primaria a ciascun pozzetto.
Incubare la piastra a quattro gradi Celsius con una rotazione delicata per tre giorni. Dopo l'incubazione dell'anticorpo primario, lavare gli embrioni con PBS integrato cinque volte per un'ora su un bilanciere a 20 RPM. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione anticorpale secondaria a ciascun pozzetto.
Incubare la piastra con un leggero dondolio a quattro gradi Celsius al buio per tre giorni. Rimuovere la soluzione anticorpale secondaria e lavare gli embrioni tre volte per 30 minuti in PBS integrato. Preparare una soluzione al 4% in peso di agarosio a basso punto di fusione in PBS con calcio e magnesio.
Allo stesso tempo, posizionare una piastra a 12 pozzetti nel bagno di perline a 55 gradi Celsius e aggiungere tre millilitri di agarosio a ciascun pozzetto. Quindi, posizionare la piastra su un banco e trasferire gli embrioni in singoli pozzetti usando un cucchiaio perforato. Utilizzare le punte delle pipette per incorporare e orientare delicatamente l'embrione in modo che sia centrato all'interno della soluzione.
Una volta orientati gli embrioni, posizionare la piastra a meno 20 gradi Celsius per 10 minuti per la solidificazione. Quindi usando un bisturi, rimuovere l'intero blocco di agarosio dal pozzo. Tagliare un blocco rettangolare attorno all'embrione, lasciando circa 0,3 centimetri del blocco su ciascun lato.
Lasciare una lunghezza extra del blocco lungo l'estremità caudale dell'embrione. Per montare l'embrione sul vibratoma, applicare prima una striscia di nastro adesivo sul supporto del campione. Orientare l'embrione in posizione verticale nella sezione superiore del blocco e super incollare il blocco di agarosio al nastro, in modo tale che la lama generi sezioni assiali in una sequenza da anteriore a posteriore.
Quindi, riempire la camera del vibratome con HBSS freddo per immergere completamente il campione e quindi circondare la camera con ghiaccio. Impostare i parametri sul vibratoma ed eseguire il sezionamento assiale seriale dell'embrione. Utilizzare una pinza per trasferire singole sezioni in un piatto separato riempito con HBSS.
Ricordarsi di usare una pinza per tenere solo l'agarosio per evitare danni ai tessuti e distruzione dei citonemi. Per eseguire la colorazione F-actina, rimuovere HBSS e incubare i paragrafi per 40 minuti con ActinRed e soluzione DAPI in PBS integrato. Dopo l'incubazione, lavare le sezioni tre volte per 20 minuti in PBS integrato.
Con un pennarello idrofobo, disegna una barriera attorno ai bordi di un vetrino per microscopio carico e aggiungi un piccolo volume di HBSS all'area di riempimento. Quindi, utilizzare la pinza per trasferire le sezioni alla diapositiva. Rimuovere l'agarosio in eccesso usando una pinza.
Una volta che tutte le sezioni sono state trasferite sul vetrino, rimuovere il liquido in eccesso mediante pipettaggio e utilizzando l'angolo di un asciugamano assorbente. Quindi aggiungere diverse gocce di mezzo di montaggio alla diapositiva. Montare il coperchio scivolare posizionandolo delicatamente sulla diapositiva.
Per l'analisi, eseguire l'imaging delle sezioni di tessuto per un minimo di tre embrioni per genotipo su un microscopio confocale o ad alta risoluzione. Le sezioni correttamente orientate preparate utilizzando questo protocollo sono mostrate qui. Rispetto al sezionamento del vibratoma, il sezionamento criostato del tessuto non ha preservato le estensioni cellulari.
Alcuni frammenti di membrana GFP-positivi sono stati rilevati tra le cellule della notocorda e del tubo neurale e tra le cellule del tubo neurale adiacenti nelle sezioni del criostato. Tuttavia, la colorazione F-actina delle estensioni cellulari nelle cellule mesenchimali che circondano il tubo neurale è stata compromessa nelle sezioni criostatali. Il sezionamento del vibratome ha garantito un'interruzione minima dell'intero embrione e delle singole sezioni di tessuto.
Le sezioni gestite in modo ottimale hanno permesso il rilevamento di ctyonemes tra cellule epiteliali neurali a piastre del pavimento localizzate adiacenti e cellule mesenchimali. Le sezioni piegate o piegate erano evidenti da una grande separazione tra la notocorda e la piastra del pavimento ventrale del tubo neurale. E una perdita di estensioni della membrana cellulare che migrano tra le cellule epiteliali.
Le sezioni colorate di F-actina e DAPI avevano una spaziatura coerente delle cellule mesenchimali e dei ctyonemes che circondavano il tubo neurale e la notocorda. Piccole distorsioni alle sezioni possono aver causato la frammentazione delle estensioni a base di actina e la formazione di grandi spazi tra le cellule, sottolineando la necessità di una manipolazione delicata. Dopo il sezionamento dell'embrione, è imperativo ridurre al minimo qualsiasi flessione o piegatura delle sezioni di tessuto.
per prevenire la rottura dei citonemi. Usando questa tecnica, possiamo visualizzare direttamente come le molecole di segnalazione, come i morfogeni, sono diffuse tra i tessuti. Questo ci sta dando nuove intuizioni su come i tessuti e gli organi sono modellati.
