Этот протокол описывает передовые методы получения данных визуализации с высоким разрешением для диагностики врожденных пороков сердца. Мы проводим функциональные оценки с неинвазивной эхокардиографией плода в сочетании с некропсией с последующей эпископической конфокальной микроскопической гистопатологией для создания последовательных стеков 2D-изображений и 3D-реконструкций для комплексной диагностики ИБС. Этот метод может прояснить подробные анатомические изменения не только при врожденных пороках сердца, но также может быть использован для исследования структурных врожденных дефектов в других органах, включая черепные дефекты лица, аномалии конечностей и скелета, а также дефекты головного мозга и других висцеральных органов.
Демонстрировать эти процедуры будут Меган Холбрук, Карла Гусман, Пейчжао Чжан и Бенджамин Гленнон, все исследователи из нашей лаборатории. После подготовки мыши к процедуре разогрейте ультразвуковой гель до температуры тела и щедро нанесите его на область визуализации. Затем поместите датчик на брюшную полость, ориентированную в горизонтальной плоскости и идентифицируйте мочевой пузырь на экране.
Как только мочевой пузырь идентифицирован, сканируйте ракообразно из мочевого пузыря, ищите плод и определяйте гестационный возраст, измеряя коронку до длины крестца. Далее используйте цветной допплер для анализа кровотока от сердца. Чтобы обеспечить фиксирующее проникновение во внутренние органы, сделайте разрезы в боковой грудной клетке и брюшной полости с помощью щипцов или рассекающих ножниц и позвольте образцу зафиксироваться в течение не менее 24 часов в холодном помещении.
Затем настройте программное обеспечение для сохранения изображений с именем, включая идентификацию образца, увеличение микроскопа и содержание изображения. Проткните образец через запястья и лодыжки. Прежде чем разрезать кожу вдоль срединной оси к хвосту, поднимите кожу в середине шеи с помощью щипцов и срежьте кожу ножницами по направлению к обеим подмышкам.
Затем срежьте кожу от пупка до ног. После встраивания образцов отрегулируйте положение лазерной проекции к центру образца на экране и отрегулируйте ручку масштабирования до 20x. Чтобы оптимизировать разрешение, установите коэффициент усиления 1, 250 В.
Разверните синюю область с помощью ручки фокусировки, а затем сбросьте коэффициент усиления примерно до 750 В для получения изображения. Затем переключите метод резки на автоматический. Установите толщину около 50 микрометров и запустите слайды.
Прекратите резку, когда легкие и дыхательные пути находятся в поле зрения. Выберите толщину резки от восьми до 10 микрометров и остановите интерактивный просмотр открытым. Откройте Microtome Communicator, чтобы начать визуализацию.
Перед сбором изображений убедитесь, что папка временного хранилища пуста. Остановите коллекцию изображений, если не видно твердой структуры. Выведите временные сохраненные файлы в одну серию изображений TIFF.
Для реконструкции 3D-изображения перетащите файлы изображений в программное обеспечение для обработки изображений. После появления всплывающего окна выберите ссылки или файлы для копирования в базу данных. Как только файл будет открыт, нажмите на меню инструментов 2D 3D реконструкции на панели инструментов и выберите 3D MPR.
Для разрешения pixel X и pixel Y введите разрешение изображения, предоставив масштаб, используемый во время ECM-изображения. Для интервала среза введите толщину среза, используемую для вырезания во время визуализации ECM. Затем используйте инструмент WWWL для настройки ширины окна и уровня окна.
Щелкните и перетащите инструмент на изображении вверх, чтобы уменьшить яркость изображения, и вниз, чтобы увеличить его. Щелкните и перетащите инструмент на изображении вправо, чтобы уменьшить контрастность изображения, и левое слово, чтобы увеличить его. Перетащите изображения в нужное положение с помощью инструмента панорамирования.
Используйте инструмент масштабирования для увеличения или сжатия изображения и инструмент поворота для поворота изображения по своему усмотрению. Теперь щелкните и перетащите цветную ось первой панели. Обратите внимание, как поворот этой оси изменяет ориентацию двух других панелей.
Поверните три оси панелей до тех пор, пока три панели не представят корональный, сагиттальный и поперечный виды образца. После того, как все три панели будут соответствующим образом расположены, ориентированы и освещены, нажмите на панель, представляющую корональный вид. Затем нажмите «Экспорт фильма» в правой части строки меню.
Нажмите на пакет и перетащите ползунки от и к ним, чтобы охватить весь интересующий регион. Для параметра интервал выберите параметр «То же самое, что и толщина» и сохраните видео с указанием ориентации представлений. Эхо показывает интактную желудочковую перегородку без внутрижелудочкового шунта и нормальные связанные с ним крупные артерии в нормальном контроле, что было подтверждено ECM.
Фронтальный вид демонстрирует связь между LA, RA, LV и RV как в эхо, так и в ECM, предполагая дефект атриовентрикулярной перегородки. Цветовой поток демонстрирует поток через LV и RV, указывающий на дефект межжелудочковой перегородки. Echo и ECM продемонстрировали двойной выход правого желудочка с дефектом межжелудочковой перегородки между LV и RV с бок о бок большими артериями.
Ультразвуковая диагностика стойкого артериального трункуса демонстрирует связь между ЛЖ и RV с одним оттоком тракта, перекрывающим оба желудочка, также подтвержденную ECM на стадии E14.5. Участки, собранные из гистологии ECM, могут быть дополнительно обработаны для иммуноокрашивания, окрашивания гематоксилином и эозином и даже экстракции нуклеиновых кислот для генотипирования и транскрипционного профилирования или экстракции белка для протеомного анализа. Изображения трехмерной реконструкции могут быть дополнительно обработаны для оценки количественных периметров, таких как площадь или объем.
Точное фенотипирование для выявления дефектов в сердечно-сосудистой анатомии имеет важное значение для создания генетически модифицированных и мутантных мышиных моделей врожденных пороков сердца для выяснения патомеханизмов врожденных пороков сердца. Это может привести к потенциальным возможностям, которые разрабатывают методы лечения и вмешательства для улучшения клинического результата у пациентов с врожденными пороками сердца.
