Наш метод направлен на генерацию сердечных полевых клеток-предшественников сердца из эмбриональных стволовых клеток мыши. Это поле сердца репортер стволовых клеток линия позволяет с высокой пропускной способностью исследования механизмов, лежащих в основе врожденного порока сердца, обеспечивая систему, которая подлежма для генетических и фармакологических манипуляций. Существует несколько камерных врожденных пороков сердца.
Повторив кардиогенез в пробирке, этот протокол позволяет изучать механизм заболевания и развитие будущих регенеративных методов лечения. Этот протокол может дать представление о том, как клетки-предшественники сердца различных камер указаны во время развития сердца. Начните с выращивания трансгенных эмбриональных стволовых клеток мыши в 0,1%желатин покрытием T25 колбы в 2i среды.
Когда клетки достигают 70 до 80% слияния, промыть культуры с PBS и добавить один миллилитр трипсина на колбу, чтобы разъединить культуру в одиночные клетки при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. Когда клетки отсоединились, нейтрализовать реакцию с четырьмя миллилитров 10 FBS в DMEM и рассчитывать клетки соответствующим методом. Разбавить клетки примерно в три раза от 10 до пяти клеток на свежую средней концентрации, и собирать клетки центрифугации.
Затем повторно покрыть гранулы в пять миллилитров свежих 2i среды для replating на новые 0,1% желатина покрытием T25 колбы. Для поколения КТК из сердечных сфероидов, собирать 2,5 раза 10 до шести отдельных трансгенных мыши эмбриональной образца стволовых клеток центрифугации, и повторного перерасхода клеток в 25 миллилитров SFD среды. Плита подвески клетки в один 150-на-25-миллиметровой стерильной пластины для инкубации при 37 градусов по Цельсию и 5%углекислого газа в течение 48 часов.
В конце инкубации соберите сердечные сфероиды в коническую трубку. Осадок сфероидов центрифугации для облегчения селективной изоляции сфероидов и избежать одиночных клеток. Resuspend сфероидов в 25 миллилитров свежей среды SFD дополняется одним нанограммом на миллилитр активина А и 1,5 нанограмма на миллилитр костного морфогенетического белка четыре.
Replate сфероиды обратно на ту же культурную пластину для 24-часовой инкубации в инкубаторе клеточной культуры. На следующий день вспомните все сердечные сфероиды путем центрифугации. Resuspend дифференцированных эмбриональных органов в 25 миллилитров свежей среды SFD для покрытия в ультра-низкой крепления, 75-сантиметровый квадрат колбы в инкубаторе культуры клеток в течение 48 часов.
Для изоляции сердечного поля конкретных КПК с помощью флуоресцентных репортеров, собирать эмбриональные тела центрифугации и разобщить 3D культур с одним миллилитр трипсина при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. В конце инкубации хорошо перемешать с помощью пипетки, чтобы разобщить клетки и нейтрализовать реакцию с четырьмя миллилитров 10%FBS в DMEM. Перейти смесь на 70-микрометровый ситечко, чтобы удалить любые неразобщенных эмбриональных тел, и осадок фильтрованных клеток центрифугации.
Чтобы сортировать CPCs по их флуоресцентное выражение репортера, повторно гранулы в 500 микролитров FACS решение и фильтровать клетки через 40-микрометровый ситечко клеток в пятими миллилитр полистирола круглого дна трубки на льду. Затем сортировать клетки, чтобы изолировать RFP-и GFP-экспрессинговых клеток FACS, собирая клетки в один миллилитр FBS. Чтобы изолировать первый по сравнению со вторым сердцем поле CPCs на основе их поверхностного белка Cxcr4 выражение, resuspend одной мыши эмбриональной стволовой клетки RFP-экспрессирующих сердечных клеток прародителя в 300 микролитров 10%FBS в PBS дополнен флуоресценции конъюгированных анти-Cxcr4 антитела.
После пяти минут при комнатной температуре, мыть клетки три раза в один-два миллилитров свежих, холодных PBS за стирку. После последней стирки, повторное стечь клетки в 500 микролитров раствора FACS и фильтровать клетки через 40-микрометровый ситечко в пятими миллилитров, круглое дно трубки. Затем сортировать клетки по их выражению Cxcr4, собирая как Cxcr4-положительных и отрицательных популяций в отдельных труб, содержащих один миллилитр FPS на трубку на льду.
Для того чтобы re-culture FACS-изолированные, сердце поле-специфические клетки heartdiac progenitor, собирают сортированные клетки центрифугацией и resuspend гранулы в среде SFD. Затем семена примерно в три раза 10 до четырех клеток на колодец в 0,1%желатина покрытием, 384-хорошо пластины. Если повышенная гибель клеток отмечается после сортировки, добавьте 10-микромолярный ингибитор ROCK к каждой колодец.
После двух дней культуры следует наблюдать спонтанное избиение. Чтобы проанализировать способность потроханные КПК дифференцироваться к кардиомиоцитам, соберите клетки в день 12 дифференциации с трипсином, как попродемонстрировано, чтобы изолировать одиночные кардиомиоциты и повторно использовать клетки в 4%paraformaldehyde. После 30 минут при комнатной температуре, собирать фиксированные клетки центрифугации и мыть гранулы в PBS, чтобы удалить избыток фиксации.
Далее, повторное использование клеток в 10%FBS в PBS, и инкубировать половину образца клетки с мышью антитропонин T антитела и использовать другую половину образца в качестве отрицательного контроля. После 30 минут при комнатной температуре, мыть клетки два раза в свежем PBS и повторно образцы в 10%FBS плюс PBS дополняется соответствующим вторичным антителом. После еще одной 30-минутной инкубации при комнатной температуре, мыть клетки два раза в свежем PBS за стирку и повторного анализа клеток в 200 микролитров PBS на трубку для анализа на поток цитометра.
Примерно через 132 часа дифференциации клетки-предшественники tbx1-RFP и Hcn4-GFP могут быть обнаружены с помощью микроскопии флуоресценции. Как правило, клетки GFP и RFP появляются примерно в одно и то же время, и две популяции клеток-предшественников продолжают расширяться в непосредственной близости и, как правило, в дополнительной модели. Корректировка концентраций активина А и костного морфогенетического белка четыре изменит процент первого по сравнению со вторым сердечным полем сердечных клеток-предшественников.
Аналогичным образом, используя RFP репортер мыши эмбриональной линии стволовых клеток, после 132 часов дифференциации, RFP-положительные клетки-предшественники сердца появляются. После иммуностимпонирования для Cxcr4, RFP-положительных, Cxcr4-положительных и RFP-положительных, Cxcr4-отрицательные клетки могут быть изолированы. Иммуностимулятор для сердечного тропонина Т на 12-й день дифференциации подтверждает, что первые клетки сердечного поля дифференцируются в основном в миоциты.
Аналогичным образом, клетки, полученные из RFP-положительных, Cxcr4-отрицательных клеток-предшественников сердца, дают результат кардиомиоцитов на гораздо более высоких процентах по сравнению с одиночными положительными клетками-предшественниками сердца Cxcr4. Иногда эмбриональные стволовые клетки мыши не могут эффективно дифференцироваться и образуют очень низкое количество клеток-предшественников сердца. Сроки, концентрация и консистенция добавления цитокинов и количество клеток имеют решающее значение для успешного поколения камерных клеток-предшественников сердца.
После этой процедуры, исследователи могут проанализировать физиологические свойства различных популяций клеток-предшественников сердца, чтобы получить дальнейшее представление об их спецификации и функции.
