Этот протокол описывает эффективный метод выделения фолликулов яичников из окружающих клеток стромы для оценки анализа экспрессии генов на этих половых клетках. Этот метод, использующий контролируемую ферментативную и механическую изоляцию, позволяет извлекать фолликулы, сохраняя при этом их целостность. Следуя этому протоколу, исследователь может оценить специфическую экспрессию генов из этих клеток.
Этот метод может быть использован для дальнейшего понимания дефицита экспрессии генов в фолликулах, связанного с заболеваниями, влияющими на функцию яичников или после воздействия токсических агентов. Начните приготовление шестилуночного планшета с добавления пяти миллилитров раствора криопротектора в первую лунку и пяти миллилитров среды Лейбовица 15 с уменьшением концентрации криопротектора в следующие четыре лунки. Извлеките флакон, содержащий фрагмент коры яичника, из жидкого азота с соблюдением правил безопасности.
Через 30 секунд при комнатной температуре, или RT, замочите флакон в двойной дистиллированной воде на две минуты. Внутри вертикального колпака осторожно перемешайте и откройте флакон с фрагментом коры яичника, прежде чем перенести содержимое в первую лунку шестилуночной пластины, помещенной на лед. Затем перенесите фрагмент коры яичников в первой лунке последовательно в каждую лунку шестилуночной пластины, содержащей снижающиеся концентрации криопротектора в пяти миллилитрах среды Лейбовица 15.
Аккуратно взбалтывайте салфетку в каждом средстве в течение пяти минут. Для выделения фолликулов перенесите размороженную ткань яичника в двухмиллиметровую решетчатую чашку Петри, заполненную 10 миллилитрами диссекционной среды, 30 микрограммами на миллилитр пенициллина G и 50 микрограммами на миллилитр стрептомицина. При необходимости отрегулируйте размер ткани с помощью скальпеля.
Сложите три части тканевого слайсера и поместите фрагмент яичника между двумя блоками. Разрежьте фрагмент пополам с помощью лезвия, скользя по блокам, чтобы получить два фрагмента толщиной 0,5 миллиметра. Разрежьте ткань с помощью измельчителя ткани, чтобы получить более мелкие кусочки.
При необходимости отрежьте оставшиеся кусочки вручную скальпелем до тех пор, пока ткань не будет раздроблена. После того, как ткань разбита, переложите фрагментированную ткань в решетчатую чашку Петри, заполненную семью миллилитрами среды для переваривания, прежде чем поместить чашку в инкубатор при 5% углекислого газа и 37 градусах Цельсия. Вынимайте чашку Петри из инкубатора каждые 10 минут.
Промойте ткань, пипеткой питательной среды вверх и вниз с помощью пипетки объемом в один миллилитр. После 45 минут инкубации в среде для разложения поместите чашку под стереомикроскоп с диапазоном увеличения от пяти до 6,3 раза и извлеките фолликулы с помощью микрокапиллярной пипетки. Выберите интересующие фолликулы и изолируйте их, всасывая их с помощью ротовой пипетки.
Если фолликулы застряли в кусочке коры, изолируйте их механически с помощью двух шприцев 27-го калибра, оторвав кору кончиком шприцев и выпустив фолликулы из стромы. Используя микрокапилляр, перенесите изолированные фолликулы в четырехлуночную пластину, содержащую 15 микролитров калиброванной питательной среды, покрытой 500 микролитрами масляной культуры. После переноса от одного до 10 фолликулов промойте их два раза двумя каплями по 15 микролитров PBS, покрытых 500 микролитрами масляной культуры, в течение пяти секунд каждый.
С помощью ротовой пипетки соберите 20 фолликулов с минимальным PBS в пустую пробирку и держите трубку на льду. После 90 минут инкубации в среде сбраживания остановите ферментативную реакцию, добавив холодоблокирующий раствор. Под химическим колпаком суспендируйте изолированные фолликулы в 100 микролитрах лизисного раствора, поставляемого с набором для экстракции РНК.
Встряхните изолированные фолликулы со скоростью 2500 об / мин в минуту, чтобы нарушить их структуру, затем добавьте 50 микролитров 100% этанола в трубку. И ненадолго закрутить трубку на высокой скорости. После вихревания перенесите весь объем трубки в узел картриджа микрофильтра, состоящий из колонны и сборной трубки.
И центрифугируйте сборку в течение 10 секунд при 16, 363g при четырех градусах Цельсия. Промойте колонку 180 микролитрами моющего раствора 1, входящего в комплект поставки, перед центрифугированием пробирки в течение 10 секунд. После двух промывок 180 микролитров промывочного раствора 2, 3 в колонну высушите фильтр, центрифугируя пробирку в последний раз, и поместите новую сборную пробирку под картридж.
Чтобы выполнить элюирование нуклеиновых кислот, сначала добавьте восемь микролитров раствора для элюирования при температуре 75 градусов Цельсия в фильтрующий узел. Через одну минуту центрифугируйте узел в течение 30 секунд. Повторите этот шаг с семью микролитрами раствора элюирования.
После этого добавьте в пробирку две международные единицы ДНКазы и ДНКазного буфера и инкубируйте пробирку в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Блокируйте ферментативную активность реагентом для инактивации ДНКазы один на 10 в течение двух минут при комнатной температуре. Затем центрифугируют пробирку в течение 1,5 минут при 16, 363 г при четырех градусах Цельсия и переносят суспензию, содержащую РНК, в новую пробирку.
С помощью спектрофотометра оцените количество РНК в образце. Используйте один микролитровый раствор элюирования в качестве заготовки и один микролитровый раствор РНК, извлеченный из изолированных фолликулов. Проверьте, составляет ли соотношение 260/280 около 2.0 для чистоты РНК.
И храните образец при температуре минус 80 градусов по Цельсию или напрямую ретротранскрибируйте его для выполнения ОТ-кПЦР. Используя этот протокол, два гомогенизированных фрагмента яичников размером 4x2x1 миллиметр от одной и той же пациентки были обработаны для выделения фолликулов. Количественное определение РНК показало, что 4,8 нанограмма на микролитр общей РНК было извлечено из фолликулов размером менее 75 микрометров с коэффициентом чистоты 1,89.
Из фолликулов размером менее 200 микрометров было извлечено 10,5 нанограмма на микролитр общей РНК с коэффициентом чистоты 1,74. Значения числа целостности РНК, или RIN, составляли 7,1 и 7,9 в первой и второй пробирках соответственно, что подтверждает качество РНК из наших образцов. После запуска стандартного цикла на системе ПЦР в реальном времени полученные пороговые значения цикла, или КТ, составили 30,87 и 29,56 для HPRT, 33,5 и 31,77 для набора лиганда и 30,71 и 30,57 для GDF9.
Ферментативное переваривание ткани является критическим моментом. Экспериментатор должен постоянно оценивать и обеспечивать целостность фолликулов во время реакции, останавливая ее при необходимости. Помимо анализа экспрессии генов, изолированные фолликулы используются для разработки экспериментальных систем для сохранения фертильности больных раком, таких как культура фолликулов in vitro или искусственный яичник.
Метод изоляции требовал обучения для извлечения большого количества интактных фолликулов. Исследователям рекомендуется убедиться, что ткань хорошо разрушена перед пищеварением.
