Бактерии, такие как E.coli, несут устойчивые к антибиотикам гены в конъюгативных плазмидах. Эти бактерии можно найти в больницах, в качестве комменсалов у животных и в водной среде. Естественные конъюгативные плазмиды горизонтально переносят гены между различными бактериальными линиями.
Мы представляем металлы для обнаружения конъюгативных плазмид и эффективности конъюгации пласта. Эта техника проста и чувствительна. Он чувствителен, потому что использует маркеры для плазмиды, донора и реципиента.
Эти маркеры являются выбираемыми, что означает, что они могут идентифицировать отдельные события в очень больших популяциях. Протоколы, которые мы представляем, полезны для изучения эволюции устойчивости к антибиотикам и для эпидемиологического надзора, то есть для мониторинга потока генов лекарственной устойчивости. Продемонстрацией процедуры будут Кейсон Уорнер, аспирант из моей лаборатории, и Пеппер Сент-Клер, студентка бакалавриата из лаборатории CAMS.
В первый день отдельно выделите доноров и реципиента из запасов глицерина на среду C, которая представляет собой агар Макконки без антибиотиков, и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. На второй день пометьте 14-миллилитровую культуральную пробирку для каждого донора и реципиента. Выберите по одной колонии каждого донора и реципиента и выращивайте их в двух миллилитрах бульона Мюллера Хинтона при 200 об/мин в течение 18 часов при 37 градусах Цельсия.
На третий день измерьте оптическую плотность 10-кратно разбавленной физиологическим раствором выращенной в течение ночи культуры на 600 нанометрах без вихря. При необходимости используйте стерилизованный физиологический раствор, чтобы отрегулировать оптическую плотность до двух. Маркируйте микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра как сопрягаемую пробирку с указанием донорского и реципиентного штаммов.
Перенесите 500 микролитров скорректированной суспензии каждого донора и реципиента в сопрягаемую трубку и аккуратно перемешайте суспензию путем инверсии. Центрифугируйте сопрягаемую трубку при комнатной температуре в течение 10 минут при 500 г. Пипеткой вынимайте 800 микролитров надосадочной жидкости из сопрягаемой трубки, не нарушая гранулы, оставляя в пробирке 200 микролитров. Инкубируйте брачную трубку в течение 18 часов при температуре 37 градусов по Цельсию.
Кроме того, в качестве негативного контроля проведите ночную культуру доноров на носителе B и реципиентов на среде A и инкубируйте тарелки в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. После инкубации, на четвертый день, добавьте 800 микролитров физиологического раствора в сопрягаемую трубку и ресуспендируйте вихревым способом. Сделайте последовательные разведения сопрягаемой суспензии и добавьте по 100 микролитров каждого разведения на пластины среды.
После того, как пластины высохнут, инкубируйте их в течение 18 часов при 37 градусах Цельсия и рассчитайте частоту конъюгации на донора или реципиента, как описано в рукописи. После извлечения ДНК из клеточных стенок бактерий с помощью простого метода экстракции для подготовки к фурункулу пометьте пробирку объемом 1,5 миллилитра в качестве пула в необходимых пробирках для ПЦР с названием гена и образца. В пробирку, помеченную как бассейн, добавьте стерильную воду, мастер-смесь для ПЦР, праймеры и полимеразу.
Аккуратно перемешайте, пипеткой вверх и вниз не менее 10 раз в охлажденной среде. Добавьте матричную ДНК в соответствующую пробирку и закрепите пробирки для ПЦР колпачками. Поместите ПЦР-пробирки в термоциклер и запустите программу для генов резистентности и репликонов, как описано в рукописи.
Для подтверждения ампликона приготовьте 1%-ный агарозный гель, добавив агарозу и буфер TAE в колбу объемом 250 миллилитров, и растопите агарозу в микроволновой печи. Как только раствор агарозы остынет примерно до 55 градусов по Цельсию, под вытяжным шкафом добавьте шесть микролитров SYBR Green и перемешайте. Налейте гель в лоток, запечатанный клейкой лентой, чтобы избежать проливания, и дайте гелю застыть в течение 15-25 минут, пока не появится помутнение.
После удаления клейкой ленты поместите гель в камеру электрофореза и добавьте буфер TAE, чтобы покрыть гель. Смешайте пять микролитров шестикратной загрузки ДНК-геля с 25 микролитрами каждой реакции, пипеткой вверх и вниз не менее 10 раз. Затем загрузите смесь в лунки, избегая пузырьков.
После добавления четырех микролитров одной килобазовой пары ДНК в первую лунку закройте крышку камеры и запустите гель на 60 минут при напряжении 120 вольт и 400 миллиамперах. Визуализируйте гель под ультрафиолетовым светом и запишите изображение. Агар Макконки отличал лактозоположительных доноров, которые продуцировали большие розовые колонии, от реципиента и трансконъюгантов, которые были лактозоотрицательными и производили меньшие бледно-желтые колонии.
Эффективность конъюгации донорского штамма SSW4955 находилась в пределах одного порядка величины, что указывает на то, что мобилизация конъюгативной плазмиды может быть обнаружена независимо от отбора, используемого для идентификации трансконъюганта. В то время как донорский штамм SSW7037 показал эффективность конъюгации в три раза ниже, что позволяет сравнивать эффективность конъюгации разных доноров и типов плазмид с одними и теми же реципиентами. Гель-электрофорез продуктов ПЦР подтвердил наличие ожидаемых репликонов в трансконъюгантах.
Этот анализ полностью зависит от выбираемых маркеров. Контроль должен быть на месте, чтобы подтвердить, что каждый отбор работает, и трансконъюганты должны быть подтверждены колориметрически или с помощью ПЦР. Представленные здесь протоколы могут быть адаптированы для изучения конъюгации in vivo или биопленочных моделей, а также для изучения переменных, модулирующих эффективность конъюгации.
Этот протокол для обнаружения мобилизуемых плазмид в масштабе значительно расширит наше понимание потока генов в окружающей среде и изучит переменные, влияющие на эффективность конъюгации.
