Этот протокол может легко генерировать сфероиды рыбок данио, 3D-модель in vitro с различным потенциальным применением в тестировании токсичности рыб. Это простой и быстрый метод получения одиночных сфероидов клеточных линий рыбок данио, очень похожих по размеру и форме. Если правильно выполнить все описанные шаги, проблем возникнуть не должно.
Сфероиды рыбок данио-рерио могут принести большую пользу механизму изучения воздействия химических веществ на рыбу, что помогает улучшить оценку экологической безопасности таких продуктов, как косметика. Продемонстрирует процедуру Ирисдорис Родригес де Соуза, доктор генетики из моей лаборатории. Для начала возьмите колбу T75 с клетками рыбок данио-рерио при слиянии около 80%.
Удалите всю среду и промойте клетки, добавив 0,01 моляра PBS в колбу для культуры с помощью пипетки. Промойте колбу с культурой с помощью PBS, осторожно встряхнув колбу, а затем снимите PBS. Добавьте три миллилитра трипсина 0,5 миллимоляра ЭДТА в колбу для культуры и выдерживайте при 28 градусах Цельсия в течение трех минут.
Для отсоединения ячеек от колбы аккуратно постучите по колбе, чтобы освободить ячейки. А затем остановить переваривание трипсина, добавив в колбу три миллилитра полной питательной среды. С помощью пипетки перенесите клеточную суспензию в коническую центрифужную трубку объемом 15 миллилитров и центрифугу при 100 G в течение пяти минут.
Затем аккуратно удалите надосадочную жидкость. Добавьте один миллилитр полной среды для соответствующей используемой клеточной линии и ресуспендируйте гранулу с помощью микропипетки. Добавьте 10 микролитров клеточной суспензии и 10 микролитров красителя Trypan blue в микропробирку, чтобы подсчитать клетки и оценить их жизнеспособность.
Смешайте клеточную суспензию и краситель с помощью пипетки и перенесите 10 микролитров этой смеси в камеру Нойбауэра. Подсчитайте клетки в четырех больших квадратах или квадрантах, расположенных по углам камеры, считая клетки, которые не принимают трипановый синий, жизнеспособными. Затем рассчитайте количество жизнеспособных ячеек, используя уравнение, показанное на экране.
Умножьте этот номер ячейки на два, чтобы вычислить окончательный номер ячейки в суспензии клеток. После расчета количества ячеек отрегулируйте суспензию ячеек на пластину 200 микролитров этой суспензии на лунку 96-луночной пластины ULA с круглым дном с количеством ячеек, необходимым для каждой клеточной линии. Приготовьте суспензию с отрегулированной концентрацией клеток в среднем резервуаре и перемешайте с помощью многоканальной микропипетки без образования пены или пузырьков.
Добавьте 200 микролитров суспензии отрегулированной ячейки в каждую лунку круглой нижней пластины ULA. с помощью многоканальной пипетки. Пластина должна быть запечатана парапленкой или клейкой герметизирующей пленкой, чтобы избежать испарения питательной среды из 96-луночной пластины.
Инкубируйте пластину на орбитальном шейкере при 70 об/мин в течение пяти дней в инкубаторе с температурой 28 градусов по Цельсию без углекислого газа. Через пять дней наблюдайте за сфероидами под микроскопом с инвертированным светом, чтобы оценить сгенерированные сфероиды. Чтобы измерить их форму и размер, получить изображения сфероидов и использовать программное обеспечение для обработки и анализа изображений.
После настройки программного обеспечения для измерения выбранной области на основе известного масштаба выберите внешнюю сторону сфероида, чтобы определить его площадь и круглость. Площадь сфероида используется для определения его размера путем вычисления диаметра d, а программное обеспечение обеспечивает цикличность сфероида по формуле, в которой используются выбранные площадь и периметр. Клеточный агрегат ZFL образуется в первые сутки орбитального встряхивания.
Клеточный агрегат увеличивает свою цикличность на третий день и достигает адекватной сфероидальной формы на пятый день. Здесь показан 16-дневный сфероид ZFL в пластине ULA. Клеточная линия ZEM2S образует сфероиды с первого дня орбитального встряхивания.
Сфероид сохраняет свою форму и увеличивается в размерах на третий день, а его максимальная округлость достигается на пятый день. Здесь показан 10-дневный сфероид ZEM2S в пластине ULA. На этом рисунке показан измеренный размер сфероидов клеточных линий ZFL и ZEM2S и измеренный индекс цикличности сфероидов ZFL и ZEM2S.
На этом графическом изображении показана картина роста сфероидов ZFL и ZEM2S. Здесь показаны сфероид ZFL и сфероид ZEM2S, образовавшиеся после пяти дней орбитального трясения при 100 об/мин. На рисунке представлена картина роста и индекс цикличности сфероидов, образующихся при скоростях вращения 70 и 100 об/мин.
70 об/мин является наиболее адекватной скоростью для формирования сфероидов ZFL и ZEM2S этим методом. Окрашивание клеточных мембран лектином Alexa Fluor 594 и ядер DAPI демонстрирует клеточную целостность в ядре сфероидов. Флуоресценция резоруфина, образованного восстановлением AlamarBlue, демонстрирует жизнеспособные клетки в ядре обоих сфероидов.
Показан анализ жизнеспособности МТТ в 3D-культуре и 2D-культуре клеточной линии ZEM2S и ZFL, не демонстрирующий существенных различий. При выполнении этой процедуры убедитесь, что вы запечатали пластины, чтобы избежать изменения pH питательных сред и испарения в лунках. Сфероиды могут применяться в различных анализах in vitro для оценки токсических эффектов в печени рыб или в исследованиях развития с использованием клеточной линии эмбриона ZEM2S.
Этот протокол может помочь продвинуть вперед разработку теста на рыбу in vitro, способствуя прогрессу исследований экотоксичности без животных.
