Этот протокол демонстрирует, как выращивать высоковоспроизводимые сфероиды и показывает, как можно проводить протеомные эксперименты для характеристики биологической функции 3D-структур. Наша 3D-культура может одновременно производить сотни биологических репликаций в одном и том же биореакторе, а метод ЖХ-МС позволяет измерить содержание тысяч белков в одном эксперименте. Демонстрацию процедуры будет демонстрировать Стефани Странски, постдок из лаборатории.
Для начала примите суспензию клеток HepG2/C3A и THLE-3. Подсчитывают количество клеток и разбавляют клеточную суспензию в полной питательной среде до получения 1 миллиона клеток в максимальном объеме 1,5 миллилитра. Промойте лунки сверхнизкой насадки, 24-луночной круглой нижней пластины с 0,5 миллилитрами питательной среды и центрифугой при 3 000 г в течение пяти минут.
Переложите клеточную суспензию на планшет и центрифугируйте ее в течение трех минут при 120 г. Затем инкубируйте пластину, чтобы инициировать образование сфероида. Затем уравновешивают биореактор за 24 часа до переноса сфероидов, заполняя камеру влажности 25 миллилитрами стерильной воды и камеру клетки девятью миллилитрами питательной среды с помощью 10-миллилитрового шприца с длинной иглой.
Затем поместите биореактор в 3D-инкубатор на 24 часа при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислого газа. Осторожно пипетируйте сфероиды вверх и вниз с помощью наконечников шириной в один миллилитр, чтобы отсоединить их от сверхнизкой пластины для крепления и переместить в чашку для культуры тканей. Чтобы захватить оставшиеся сфероиды, промойте планшет 0,5 миллилитрами предварительно подогретой питательной среды и перенесите их в чашку для культивирования.
С помощью светового микроскопа оцените размер, компактность и округлость сфероидов, чтобы выбрать те, которые имеют адекватную форму. Переместите выбранный сфероид в уравновешивающий биореактор, заполненный пятью миллилитрами свежей питательной среды. Затем заполните весь биореактор свежей питательной средой.
Расположите биореактор в 3D-инкубаторе и отрегулируйте скорость вращения с помощью блока управления. Каждые два-три дня заменяйте 10 миллилитров старой питательной среды на 10 миллилитров свежей. Меняйте скорость вращения каждый раз после замены носителя.
Культивируйте сфероиды в течение 15 дней и разделите их между двумя свежими биореакторами. Откройте 3D-приложение, установленное на планшете, выберите биореактор и сделайте снимок. В качестве альтернативы поместите черный фон позади биореактора и убедитесь, что свет не отражается на камере клетки.
Сделайте снимок как можно ближе к биореактору. Затем соберите сфероиды, удалив пять миллилитров среды из биореактора с помощью шприца, прикрепленного к длинной игле через верхний порт. Убедитесь, что сфероиды опускаются к центру нижней части биореактора.
Теперь откройте передний порт и соберите сфероиды с помощью наконечника шириной в один миллилитр. Переложите эти сфероиды в микроцентрифужные пробирки, центрифугируйте при 500 г в течение пяти минут и утилизируйте среду. Промойте сфероид, добавив 200 микролитров HBSS, чтобы удалить FBS.
После этого проводят центрифугирование при 500г в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Затем быстро погрузите гранулу сфероида в жидкий азот, чтобы заморозить ее, и храните эту замороженную гранулу при температуре минус 80 градусов Цельсия до дальнейшей обработки. Чтобы лизировать клетки, возьмите пробирку с собранными сфероидами и ресуспендируйте их в 25 микролитрах 5%-ного SDS.
Гомогенизируйте гранулы, пипетируя вверх и вниз. Далее растворяют один микрограмм образцов и 10 микролитров 0,1%-ной трихлоруксусной кислоты. После экстракции белка и очистки образцов настройте метод сбора МС для генерации спектров МС/МС из идентифицированных пептидных сигналов.
Затем переложите планшет в нанолитровый автосамплер жидкостной хроматографии. Установите полное MS-сканирование на соотношение массы к заряду 300 к 1,100 в Orbitrap. Установите разрешение на 120000 и установите цель автоматической регулировки усиления на 125.
Затем установите MS/MS в Orbitrap с последовательным окном изоляции с отношением массы к заряду 50. Наведите цель автоматической регулировки усиления на 400 и установите более высокую энергию диссоциации столкновения на 30. Согласно анализу жизнеспособности сфероидов, уровни аденилаткиназы увеличиваются до 17-го дня, что приводит примерно к 7% гибели клеток.
После этого уровень смертности снижается до уровня ниже 5%Кроме того, анализ первого главного компонента выявляет четкое различие между сфероидными образцами и плоскоклеточными культурами. Протеомный анализ показал, что сфероиды THLE-3 и HepG2/C3A имеют схожие профили, отражающие функцию печени. Кроме того, сфероиды показали гиперэкспрессию двух изоформ металлотионеинов по сравнению с плоскими клетками.
Функционально сгруппированные сети показали обогащение онтологией генов для углеводного метаболического процесса в сферах HepG2/C3A и THLE-3. Во избежание разлива питательной среды не открывайте и не закрывайте переднее отверстие, когда камера ячейки полностью заполнена жидкостью. Пробоподготовка и анализ, описанные в этом протоколе, могут быть использованы для исследования протеома клеточной культуры методами 2D и 3D, а также образцов тканей.
