В описанной модели силикоза мышей, полученной путем внутрилазерной инфузии кристаллической кварцевой пыли, вся суспензия CSD несколько раз в значительной степени моделировала возникновение и развитие силикоза человека. Этот метод экономит время и уровень, а также практичен и эффективен. Кроме того, не вызывает механических повреждений верхних дыхательных путей из-за операции.
Этот метод также может быть использован для создания моделей заболеваний вирусов, бактерий и т.д. Продемонстрировать процедуру будет Ханбин Цао, студент магистратуры из моей лаборатории, умеющий готовить модель мыши с силикозом. Начните с приготовления кристаллической кремнеземной пыли или CSD, по крайней мере, за один день до введения назальных капельниц.
Для этого растирайте кремнезем в агатовой ступке в течение получаса. Чтобы проверить размер и форму частиц, подготовьте образец для сканирующей электронной микроскопии или СЭМ с помощью проводящей ленты для связывания частиц кремния. С помощью фена аккуратно сдуйте непрочно склеенные частицы, прежде чем приступить к съемке изображения.
Далее смешайте молотый диоксид крема и стерильный физраствор в концентрации 20 миллиграмм на миллилитр с помощью ультразвукового шейкера. Наконец, встряхните приготовленную суспензию CSD в течение 10 секунд. Введите 50 микролитров CSD мыши, находящейся под наркозом, через назальную капельницу в течение четырех-восьми секунд.
Обработайте контрольную мышь равным количеством физиологического раствора, затем, придерживая тело мыши ладонью, большим и указательным пальцами зажмите кожу на задней части шеи, а остальными пальцами фиксируйте задние конечности мыши. Осторожно нажмите на область сердцебиения мыши другим указательным пальцем от пяти до 10 раз в течение пяти секунд. Нагревайте залитую парафином легочную ткань на горячей плите при температуре 60 градусов Цельсия в течение четырех часов.
Чтобы депарафинизировать и увлажнить парафиновый срез, дважды замочите предметное стекло в ксилоле на 30 минут, затем последовательно окуните предметное стекло на пять минут каждое в безводный 95%85% и 75%-ный этанол и, наконец, в деионизированную воду, затем поместите предметное стекло в ведро для окрашивания гематоксилином на 10 минут, а затем осторожно промойте под проточной водой в течение пяти минут. Опустите его в ведро для окрашивания эозина на 10 секунд. После обезвоживания образца в 75%85%95% и безводном этаноле в течение пяти минут каждый, очистите участок ткани, погрузив его в ксилол на пять минут, и запечатайте примерно 60 микролитрами капель нейтральной смолы.
Осторожно поместите слайд крышки на секцию. Для окрашивания по Массону окрасьте депарафинизированные и гидратированные образцы парафина свежеприготовленным 50%-ным гематоксилином Вейгерта в течение 10 минут, затем, замочив ткань в кислом этаноловом сжижении в течение 10 секунд, осторожно промойте предметное стекло проточной водой для воронения ядер. Далее образец окрашивают каплями красного красящего раствора в течение семи минут, и промывают рабочим раствором 30%-ной соляной кислоты в течение одной минуты.
После погружения предметного стекла в 95%-ный спирт на 20 секунд дважды обезвоживают образец безводным этанолом в течение одной-трех секунд и, как было показано ранее, очищают и герметизируют образец. Для окрашивания Sirius red инфильтрируйте депарафинизированный и гидратированный участок в течение одного часа раствором для окрашивания Sirius red, затем окрашивайте ядра клеток в течение 8-10 минут раствором для окрашивания гематокслина Mayer. Осторожно промойте его под проточной водой в течение 10 минут, прежде чем обезвоживать, очищать и герметизировать предметное стекло.
Пропитайте депарафинизированный и гидратированный образец парафина 30 миллилитрами раствора для извлечения антигена ЭДТА в концентрации три миллиграмма на миллилитр. Прокипятите образец в течение 20–30 минут, а затем промойте его деионизированной водой и инкубируйте в PBST в течение пяти минут. Образец замочить на 15 минут свежеприготовленным 0,3%-ным раствором перекиси водорода и трижды промыть по пять минут ПБСТ.
Пермеабилизируют мембрану образца в течение 15 минут 0,3%-ным раствором Triton 100 и блокируют 30-40 микролитрами 5%-ного бычьего сывороточного альбумина или BSA в течение одного часа. После удаления блокирующего раствора добавляют соответствующим образом разведенные первичные антитела NF-kappa B и CD-68 и инкубируют образец в течение ночи при температуре от двух до восьми градусов Цельсия во влажной коробке для предметных стекол микроскопа IHC. На следующий день, после переноса образца при комнатной температуре на один час, промывают его три раза по пять минут каждый с ПБСТ.
Инкубируйте образец в течение одного часа в вторичных антителах, меченных пероксидазой хрена кролика, при комнатной температуре. После инкубации образцы еще раз промывают три раза по пять минут каждый с PBST, затем инкубируют образец с субстратом DAB, соответствующим меченому ферментом антителом, в течение 5-20 минут. После гашения реакции деионизированной водой образец окрашивают в течение 30 секунд гематоксилином Вейгерта.
Промойте его под проточной водой в течение одной минуты, обезвоживайте, очистите и запечатайте салфетку. Прежде чем приступить к вестерн-блоттингу, гомогенизируйте ткань рабочим раствором RIPA на льду в течение пяти минут с помощью ручной электрической шлифовальной машины. Выдерживают в течение одного часа на льду при встряхивании и центрифугируют гомогенат при 14 800 Г в течение 15 минут при температуре четыре градуса Цельсия.
Соберите надосадочную жидкость и определите концентрацию белка с помощью набора для анализа белка BCA. Добавьте 20 микролитров 5-кратного загрузочного буфера в надосадочную жидкость, затем нагрейте шесть микрограммов на микролитр раствора для хранения белка, приготовленного с помощью RIPA, в металлической ванне при температуре 100 градусов Цельсия в течение 20 минут. Храните по 100 микролитров аликвот белкового раствора в каждой пробирке при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для электрофореза разбавьте аликвоты до двух-трех микрограммов на микролитр лизатом РИПА, затем добавьте 20 микрограммов образца на лунку для запуска геля. Перенесите белок на мембрану из ПВДФ, предварительно активированную метанолом, на 20 секунд методом влажного переноса с током 400 миллиампер в течение одного-двух часов. После промывания мембраны пять раз по пять минут раствором ПБСТ заблокируйте 5%-ным БСА или обезжиренным молоком на один час.
Погрузите полоски в раствор первичных антител, содержащий NF-каппа В и бета-актин, разбавленный 5% БСА. Осторожно встряхните полоски в течение ночи при температуре от двух до восьми градусов по Цельсию, прежде чем промыть их PBST. Далее полоски инкубируют сначала в разбавленном вторичном антителе в течение одного часа при комнатной температуре при легком встряхивании, а затем с усиленным хемилюминесцентным проявителем в течение трех минут.
Поместите полоску на гелевый имидж-сканер в течение 20 секунд и измерьте значение серого полоски, чтобы оценить уровень белка с помощью системного программного обеспечения. СЭМ-изображения CSD показали, что частицы имеют неправильную форму. Окрашивание в красный цвет Sirius, проведенное для измерения отложения коллагена, показало, что прогрессирование легочного фиброза у мышей значительно ускорялось при воздействии CSD в течение одного месяца.
Поляризационная микроскопия выявила три различных типа коллагеновых волокон, из которых коллагеновые волокна первого типа, показанные красным цветом, являются фактором риска развития силикоза, однако в группе носителя не было обнаружено значительного фиброза. На это также указывали соответствующие баллы по шкале фиброза. При ОФ-окрашивании легочной ткани мыши, обработанной ЦСД, выявлены типичные кремнеземные узелки, характеризующиеся разжиженным некрозом после фагоцитоза КСД в центре, окруженном макрофагами на периферии.
Окрашивание по Массону также показало, что узелки были обогащены CSD, сопровождающимся фиброзом. Иммуногистохимическое окрашивание CD-68 дополнительно выявило широкое присутствие макрофагов в легочной ткани. Микроскопия поляризованного света показала, что эти макрофаги проглотили CSD, вызвав тяжелое повреждение легких.
Иммуногистохимическое окрашивание показало более высокое окрашивание NF-kappa B, что указывает на более высокую воспалительную реакцию в группе, получавшей CSD, чем в группе носителя. Репрезентативная вестерн-блоттинг также показала, что мыши, получавшие CSD, имели более высокую экспрессию NF-kappa B в легких, и разница в экспрессии между двумя группами была значительной. Чтобы избежать обструкции дыхания и способствовать восстановлению дыхания, область сердца мыши необходимо осторожно помассировать от пяти до 10 раз, как показано после пятисекундного периода.
Эта модель может исследовать некоторый основной механизм силикоза и помочь в скрининге терапевтических препаратов, а также установить такие важные параметры, как дозировка и продолжительность. Эта технология предлагает удобный, эффективный и экономичный способ подвергнуть модели мышей воздействию твердых частиц, независимо от того, добавляют ли они бактерии. Наблюдение за поведением мышей может помочь в определении потенциальных последствий вдыхания твердых частиц.
