Kristal silika tozunun intra lazer infüzyonu ile oluşturulan tarif edilen fare silikoz modelinde, tüm CSD süspansiyonu birkaç kez insan silikozunun oluşumunu ve gelişimini büyük ölçüde simüle etti. Bu yöntem, pratik ve etkili olduğu kadar zaman tasarrufu ve seviye tasarrufu sağlar. Ayrıca, operasyon nedeniyle üst solunum yollarında mekanik yaralanmaya neden olmaz.
Bu yöntem aynı zamanda virüs, bakteri vb. hastalık modellerini hazırlamak için de kullanılabilir. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan bir yüksek lisans öğrencisi olan ve silikoz fare modelini hazırlama konusunda yetenekli olan Hangbing Cao olacak. Burun damlalarını uygulamadan en az bir gün önce kristal silika tozunu veya CSD'yi hazırlayarak başlayın.
Bunu yapmak için, silikayı bir akik harcında yarım saat öğütün. Parçacık boyutunu ve şeklini kontrol etmek için, silikon parçacıklarını bağlamak için iletken bant kullanarak numuneyi taramalı elektron mikroskobu veya SEM için hazırlayın. Bir saç kurutma makinesi kullanarak, görüntüyü yakalamaya devam etmeden önce sıkıca bağlanmamış parçacıkları nazikçe üfleyin.
Daha sonra, öğütülmüş silika ve steril salini, ultrasonik bir çalkalayıcı kullanarak mililitre başına 20 miligram konsantrasyonda karıştırın. Son olarak, hazırlanan CSD süspansiyonunu 10 saniye boyunca girdaplayın. Anestezi uygulanmış fareye dört ila sekiz saniye boyunca burun damlası yoluyla 50 mikrolitre CSD uygulayın.
Kontrol faresine eşit miktarda salin uygulayın, ardından farenin gövdesini avuç içi ile tutun, farenin arka bacaklarını diğer parmaklarınızla sabitlerken başparmak ve işaret parmağınızla boynun arkasındaki cildi sıkıştırın. Farenin kalp atış alanına diğer işaret parmağıyla beş saniye boyunca beş ila 10 kez hafifçe bastırın. Parafine gömülü akciğer dokusunu sıcak bir plaka üzerinde 60 santigrat derecede dört saatten fazla ısıtın.
Parafin bölümünü mumdan arındırmak ve nemlendirmek için, slaytı iki kez 30 dakika ksilen içinde bekletin, ardından slaytı sırayla beş dakika boyunca susuz% 95% 85 ve% 75 etanole ve son olarak deiyonize suya batırın, ardından slaytı beş dakika boyunca akan su altında hafifçe durulamadan önce 10 dakika hematoksilen boyama kovasına koyun. Eozin boyama kovasına 10 saniye batırın. Numuneyi %75, %85, %95 ve susuz etanol içinde her biri beş dakika dehidre ettikten sonra, doku bölümünü beş dakika boyunca ksilene batırarak temizleyin ve yaklaşık 60 mikrolitre nötr reçine damlası ile kapatın.
Kapak sürgüsünü dikkatlice bölümün üzerine yerleştirin. Masson boyama için, mumdan arındırılmış ve hidratlanmış parafin örneklerini taze hazırlanmış %50 Weigert'in hematoksilen ile 10 dakika boyayın, ardından dokuyu asidik etanol sıvılaştırmasına 10 saniye batırdıktan sonra, çekirdeğin mavileşmesi için slaytı akan su ile hafifçe durulayın. Daha sonra, numuneyi yedi dakika boyunca kırmızı boyama solüsyonu damlaları ile boyayın ve bir dakika boyunca% 30 hidroklorik asit çalışma solüsyonu ile yıkayın.
Slaytı 20 saniye boyunca %95 alkole batırdıktan sonra, numuneyi iki kez bir ila üç saniye susuz etanol ile kurutun ve daha önce gösterildiği gibi numuneyi temizleyin ve kapatın. Sirius kırmızı boyama için, Sirius kırmızı boyama solüsyonu ile bir saat boyunca mumsuz ve hidratlı bölüme sızın, ardından hücre çekirdeklerini Mayer hematokslyn boyama solüsyonu ile sekiz ila 10 dakika boyayın. Slaytı kurutmadan, temizlemeden ve mühürlemeden önce 10 dakika akan su altında nazikçe durulayın.
Mumdan arındırılmış ve hidratlanmış parafin örneğini, mililitre başına üç miligramlık 30 mililitre EDTA antijen alma çözeltisi ile sızdırın. Numuneyi deiyonize suyla yıkamadan ve PBST'de beş dakika inkübe etmeden önce 20 ila 30 dakika kaynatın. Numuneyi taze hazırlanmış% 0.3 hidrojen peroksit çözeltisi ile 15 dakika bekletin ve her biri PBST ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
Numunenin zarını 15 dakika boyunca% 0.3 Triton 100 çözeltisi ile geçirgen hale getirin ve bir saat boyunca 30 ila 40 mikrolitre% 5 sığır serum albümini veya BSA ile bloke edin. Bloke edici çözeltiyi çıkardıktan sonra, uygun şekilde seyreltilmiş primer antikorlar NF-kappa B ve CD-68'i ekleyin ve numuneyi bir mikroskop lamı IHC ıslak kutusunda gece boyunca iki ila sekiz santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, numuneyi bir saat oda sıcaklığına aktardıktan sonra, her biri PBST ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.
Numuneyi oda sıcaklığında tavşan anti-fare yaban turpu peroksidaz etiketli ikincil antikorlarda bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, numuneleri her biri PBST ile beş dakika boyunca üç kez tekrar yıkayın, ardından numuneyi enzim etiketli antikora karşılık gelen DAB substratı ile beş ila 20 dakika inkübe edin. Reaksiyonu deiyonize su ile söndürdükten sonra, numuneyi 30 saniye boyunca Weigert'in hematoksilen ile karşı boyayın.
Akan su altında bir dakika durulayın, kurutun, temizleyin ve dokuyu kapatın. Western blot analizine geçmeden önce, el tipi bir elektrikli öğütücü kullanarak dokuyu RIPA çalışma solüsyonu ile buz üzerinde beş dakika homojenize edin. Çalkalayarak buz üzerinde bir saat inkübe edin ve homojenatı 14.800 G'de dört santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin.
Süpernatanı toplayın ve bir BCA protein tahlil kiti ile protein konsantrasyonunu belirleyin. Süpernayana 20 mikrolitre 5X yükleme tamponu ekleyin, ardından RIPA ile hazırlanan mikrolitre protein depolama çözeltisi başına altı mikrogramı metal bir banyoda 100 santigrat derecede 20 dakika ısıtın. Her tüpte eksi 80 santigrat derecede 100 mikrolitre protein çözeltisi saklayın.
Elektroforez için, alikotları RIPA lizat ile mikrolitre başına iki ila üç mikrograma seyreltin, ardından jeli çalıştırmak için oyuk başına 20 mikrogram numune ekleyin. Proteini, bir ila iki saat boyunca 400 miliamper akımlı ıslak transfer yöntemini kullanarak 20 saniye boyunca metanol ile önceden aktive edilmiş bir PVDF membranına aktarın. Membranı her biri PBST solüsyonu ile beş dakika boyunca beş kez yıkadıktan sonra,% 5 BSA veya yağsız süt ile bir saat boyunca bloke edin.
Şeritleri, NF-kappa B ve %5 BSA ile seyreltilmiş beta aktin içeren birincil antikor çözeltisine daldırın. Şeritleri PBST ile yıkamadan önce gece boyunca iki ila sekiz santigrat derecede hafifçe çalkalayın. Daha sonra, şeritleri, önce seyreltilmiş ikincil antikorda oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe çalkalayarak ve daha sonra üç dakika boyunca gelişmiş kemilüminesans geliştiricisi ile inkübe edin.
Şeridi 20 saniye boyunca bir jel görüntüleyiciye maruz bırakın ve sistem yazılımı tarafından protein seviyesini değerlendirmek için şeridin gri değerini ölçün. CSD'nin SEM görüntüleri, parçacıkların düzensiz şekilli olduğunu gösterdi. Kollajen birikimini ölçmek için yapılan Sirius kırmızı boyama, farelerde pulmoner fibrozun ilerlemesinin bir ay boyunca CSD'ye maruz kaldıktan sonra önemli ölçüde hızlandığını gösterdi.
Polarize mikroskopi, kırmızı ile gösterilen birinci tip kollajen liflerinin silikozis için bir risk faktörü olduğu üç farklı kollajen lifi ortaya çıkardı, ancak araç grubunda önemli bir fibrozis bulunmadı. Bu aynı zamanda ilgili fibroz skorları ile de gösterildi. CSD ile tedavi edilen fare akciğer dokusunun HE boyaması, periferde makrofajlarla çevrili merkezde CSD'nin fagositozundan sonra sıvılaştırılmış nekroz ile karakterize tipik silika nodülleri gösterdi.
Masson boyaması ayrıca nodüllerin fibrozis ile birlikte CSD ile zenginleştiğini gösterdi. CD-68'in immünohistokimya boyaması ayrıca akciğer dokusunda makrofajların geniş varlığını ortaya koydu. Polarize ışık mikroskobu, bu makrofajların CSD'yi yuttuğunu ve ciddi akciğer hasarına neden olduğunu gösterdi.
İmmünohistokimya boyamasında daha yüksek NF-kappa B boyaması görüldü, bu da CSD ile tedavi edilen grupta araç grubuna göre daha yüksek inflamatuar yanıtı gösterdi. Temsili western blot ayrıca CSD ile tedavi edilen farelerin akciğerde daha yüksek NF-kappa B ekspresyonuna sahip olduğunu ve iki grup arasındaki ekspresyon farkının önemli olduğunu gösterdi. Solunum tıkanıklığını önlemek ve solunum iyileşmesini desteklemek için, farenin kalp bölgesine beş saniyelik bir süreden sonra gösterildiği gibi beş ila 10 kez hafifçe masaj yapılmalıdır.
Bu model, silikozun altında yatan bazı mekanizmaları keşfedebilir ve dozaj ve süre gibi önemli parametrelerin oluşturulmasının yanı sıra terapötik ilaç taramasına yardımcı olabilir. Bu teknoloji, fare modellerini bakteri ekleyip eklemediğine bakılmaksızın partikül maddeye maruz bırakmak için uygun, etkili ve ekonomik bir yol sunar. Farelerin davranışlarının izlenmesi, partikül maddenin solunmasının potansiyel etkilerinin belirlenmesine yardımcı olabilir.
