No modelo descrito de silicose em camundongos gerada por infusão intralaser de pó de sílica cristalina, todas as suspensões de refrigerantes simularam várias vezes a ocorrência e o desenvolvimento de silicose humana em grande medida. Este método é de economia de tempo e de nível, além de prático e eficaz. Além disso, não causa nenhuma lesão mecânica no trato respiratório superior devido à operação.
Este método também pode ser usado para preparar modelos de doenças de vírus, bactérias, etc. Quem demonstrará o procedimento será Hangbing Cao, aluno de mestrado do meu laboratório, habilidoso na preparação do modelo de camundongo silicose. Comece com a preparação do pó de sílica cristalina ou refrigerante pelo menos um dia antes de administrar os gotejamentos nasais.
Para isso, triture a sílica em uma argamassa de ágata por meia hora. Para verificar o tamanho e a forma das partículas, prepare a amostra para microscopia eletrônica de varredura ou MEV usando fita condutora para ligar as partículas de silício. Usando um secador de cabelo, sopre suavemente as partículas não firmemente coladas antes de prosseguir para capturar a imagem.
Em seguida, misture a sílica moída e o soro fisiológico estéril em uma concentração de 20 miligramas por mililitro usando um agitador ultrassônico. Por fim, coloque a suspensão preparada por 10 segundos. Administrar 50 microlitros de MSD ao camundongo anestesiado por gotejamento nasal por quatro a oito segundos.
Trate o mouse de controle com uma quantidade igual de soro fisiológico, em seguida, segurando o corpo do mouse com a palma da mão, aperte a pele na parte de trás do pescoço com o polegar e o indicador enquanto fixa os membros posteriores do mouse com os outros dedos. Pressione suavemente a área de batimento cardíaco do mouse com o outro dedo indicador cinco a 10 vezes por cinco segundos. Aqueça o tecido pulmonar embutido em parafina em uma placa quente a 60 graus Celsius por mais de quatro horas.
Para desencecar e hidratar a seção de parafina, mergulhe a lâmina em xileno por 30 minutos duas vezes, depois mergulhe sequencialmente a lâmina por cinco minutos cada em anidro 95%85% e 75% etanol e, finalmente, em água deionizada, coloque a lâmina no balde corante de hematoxilina por 10 minutos antes de enxaguar suavemente em água corrente por cinco minutos. Mergulhe-o no balde de coloração de eosina por 10 segundos. Após desidratar a amostra em 75%85%95% e etanol anidro por cinco minutos cada, limpar o corte do tecido mergulhando-o em xileno por cinco minutos e selá-lo com aproximadamente 60 microlitros de gotas de resina neutra.
Coloque cuidadosamente o slide da tampa sobre a seção. Para a coloração de Masson, corar as amostras de parafina desparafinadas e hidratadas com hematoxilina de Weigert a 50% recém-preparada por 10 minutos e, após imersão do tecido em liquifação ácida de etanol por 10 segundos, enxaguar suavemente a lâmina com água corrente para o rubor dos núcleos. Em seguida, corar a amostra com gotas de solução corante vermelha por sete minutos e lavar com solução de trabalho de ácido clorídrico a 30% por um minuto.
Depois de mergulhar a lâmina em álcool a 95% por 20 segundos, desidratar a amostra com etanol anidro por um a três segundos duas vezes e, como demonstrado anteriormente, limpar e selar a amostra. Para a coloração Sirius red, infiltrar o corte desparafinado e hidratado por uma hora com solução corante Sirius red e, em seguida, corar os núcleos celulares por oito a 10 minutos com solução de coloração hematoxlyn Mayer. Enxágue suavemente em água corrente por 10 minutos antes de desidratar, limpar e selar a lâmina.
Infiltrar-se na amostra de parafina desparafinada e hidratada com 30 mililitros de uma solução de recuperação de antígeno EDTA de três miligramas por mililitro. Ferver a amostra por 20 a 30 minutos antes de lavá-la com água deionizada e incubá-la em PBST por cinco minutos. Deixe a amostra de molho por 15 minutos com solução de peróxido de hidrogênio a 0,3% recém-preparada e lave-a três vezes por cinco minutos cada com PBST.
Permeabilizar a membrana do espécime por 15 minutos com solução de Triton 100 a 0,3% e bloquear com 30 a 40 microlitros de albumina de soro bovino a 5% ou BSA por uma hora. Depois de remover a solução de bloqueio, adicionar anticorpos primários adequadamente diluídos NF-kappa B e CD-68 e incubar o espécime durante a noite a dois a oito graus Celsius em uma caixa úmida IHC de lâmina de microscópio. No dia seguinte, após transferir a amostra para a temperatura ambiente por uma hora, lave-a três vezes por cinco minutos cada com PBST.
Incubar a amostra durante uma hora em anticorpos secundários marcados com peroxidase de rábano de coelho anti-rato à temperatura ambiente. Após a incubação, lavar as amostras novamente três vezes por cinco minutos cada com PBST e, em seguida, incubar a amostra com o substrato DAB correspondente ao anticorpo marcado com enzima por cinco a 20 minutos. Após extinguir a reação com água deionizada, contracorar a amostra por 30 segundos com hematoxilina de Weigert.
Enxágue em água corrente por um minuto, desidrate, limpe e sele o tecido. Antes de proceder à análise de western blot, homogeneizar o tecido com solução de trabalho RIPA sobre gelo por cinco minutos usando um moedor elétrico portátil. Incubar durante uma hora no gelo com agitação e centrifugar o homogeneizado a 14, 800 G durante 15 minutos a quatro graus Celsius.
Colete o sobrenadante e determine a concentração de proteína com um kit de ensaio de proteína BCA. Adicione 20 microlitros de tampão de carregamento 5X ao sobrenadante e, em seguida, aqueça os seis microgramas por microlitro de solução de armazenamento de proteína preparada com RIPA em um banho de metal a 100 graus Celsius por 20 minutos. Armazenar alíquotas de 100 microlitros da solução proteica em cada tubo a menos 80 graus Celsius.
Para eletroforese, diluir as alíquotas para dois a três microgramas por microlitro com lisado de RIPA e, em seguida, adicionar 20 microgramas de amostra por poço para executar o gel. Transferir a proteína para uma membrana de PVDF pré-ativada com metanol por 20 segundos usando o método de transferência úmida com corrente de 400 miliamperes por uma a duas horas. Após lavar a membrana cinco vezes por cinco minutos cada com solução de PBST, bloquear com BSA a 5% ou leite desnatado por uma hora.
Submergir as tiras na solução de anticorpos primários contendo NF-kappa B e beta actina diluída com BSA a 5%. Agite as tiras suavemente durante a noite a dois a oito graus Celsius antes de lavá-las com PBST. Em seguida, incubar as tiras, primeiro no anticorpo secundário diluído por uma hora à temperatura ambiente com agitação suave e, em seguida, com revelador de quimioluminescência aprimorado por três minutos.
Exponha a tira a um imageador de gel por 20 segundos e meça o valor de cinza da tira para avaliar o nível de proteína pelo software do sistema. As imagens de MEV do MSC mostraram que as partículas tinham forma irregular. A coloração Sirius red realizada para medir a deposição de colágeno mostrou que a progressão da fibrose pulmonar em camundongos foi significativamente acelerada após a exposição ao DSC por um mês.
A microscopia polarizadora revelou três tipos diferentes de fibras colágenas, das quais as fibras colágenas tipo um mostradas em vermelho são um fator de risco para silicose, no entanto, nenhuma fibrose significativa foi encontrada no grupo veículo. Isso também foi indicado pelos respectivos escores de fibrose. A coloração HE do tecido pulmonar de camundongos tratados com DSC mostrou nódulos típicos de sílica caracterizados por necrose liquefeita após fagocitose de MSC no centro circundado por macrófagos na periferia.
A coloração de Masson também mostrou que os nódulos estavam enriquecidos com MSC acompanhada de fibrose. A coloração imunoistoquímica do CD-68 revelou ainda a ampla presença de macrófagos no tecido pulmonar. A microscopia de luz polarizada mostrou que esses macrófagos haviam ingerido DSC, causando lesão pulmonar grave.
A coloração imunoistoquímica mostrou maior marcação pelo NF-kappa B, indicando maior resposta inflamatória no grupo tratado com DSC do que no grupo veículo. O western blot representativo também mostrou que os camundongos tratados com DSC apresentaram maior expressão de NF-kappa B no pulmão, e a diferença na expressão entre os dois grupos foi significativa. Para evitar obstrução respiratória e promover a recuperação respiratória, a área cardíaca do camundongo deve ser massageada suavemente de cinco a 10 vezes, conforme demonstrado após um período de cinco segundos.
Esse modelo pode explorar alguns mecanismos subjacentes da silicose e auxiliar na triagem terapêutica de drogas, além de estabelecer parâmetros cruciais, como dosagem e duração. Essa tecnologia oferece um meio conveniente, eficaz e econômico de expor modelos de camundongos a material particulado se isso adicionar bactérias. O monitoramento do comportamento de camundongos pode auxiliar na determinação dos efeitos potenciais da inalação de material particulado.
