通过反复吸入结晶二氧化硅粉尘建立的矽肺小鼠模型

在所描述的晶体二氧化硅粉尘激光内输注产生的小鼠矽肺病模型中，所有CSD悬浮液多次模拟了人类矽肺病的发生和发展。这种方法既省时又省级，实用有效。此外，不会因手术而对上呼吸道造成机械损伤。

该方法还可用于制备病毒、细菌等的疾病模型。演示该程序的将是我实验室的硕士生曹航兵，他擅长制备矽肺小鼠模型。在进行鼻滴之前至少一天，首先准备结晶二氧化硅粉或 CSD。

为此，在玛瑙研钵中研磨二氧化硅半小时。为了检查颗粒大小和形状，使用导电胶带准备样品进行扫描电子显微镜或SEM以结合硅颗粒。使用吹风机轻轻吹走未牢固粘合的颗粒，然后再继续拍摄图像。

接下来，使用超声波振荡器将磨碎的二氧化硅和无菌盐水以每毫升 20 毫克的浓度混合。最后，涡旋准备好的CSD悬浮液10秒钟。通过鼻滴给麻醉的小鼠施用 50 微升 CSD，持续 4 至 8 秒。

用等量的生理盐水处理对照小鼠，然后用手掌握住小鼠的身体，用拇指和食指捏住脖子后面的皮肤，同时用其他手指固定小鼠的后肢。用另一根食指轻轻按压鼠标的心脏跳动区域 5 到 10 次，持续 5 秒钟。在60摄氏度的热板上加热石蜡包埋的肺组织四个多小时。

为了对石蜡切片进行脱蜡和水合，将载玻片在二甲苯中浸泡两次30分钟，然后依次将载玻片浸入无水95%85%和75%乙醇中各浸泡5分钟，最后浸入去离子水中，然后将载玻片放入苏木精染色桶中10分钟，然后在流水下轻轻冲洗5分钟。将其浸入伊红染色桶中 10 秒钟。将样品在75%85%95%和无水乙醇中各脱水5分钟后，将其浸入二甲苯中5分钟以清除组织切片，并用约60微升中性树脂滴密封。

小心地将盖玻片放在该部分上。对于Masson染色，用新鲜制备的50%Weigert苏木精对脱蜡和水合的石蜡样品染色10分钟，然后在将组织浸泡在酸性乙醇液化中10秒钟后，用流水轻轻冲洗载玻片以使细胞核变蓝。接下来，用红色染色液滴对样品染色7分钟，并用30%盐酸工作溶液洗涤1分钟。

将载玻片浸入 95% 酒精中 20 秒后，用无水乙醇将样品脱水 1 至 3 秒两次，如前所述，清除并密封样品。对于天狼星红染色，用天狼星红染色溶液浸润脱蜡和水合部分一小时，然后用Mayer苏血染色溶液对细胞核染色8至10分钟。在流水下轻轻冲洗 10 分钟，然后脱水、清除和密封载玻片。

用 30 毫升每毫升 3 毫克的 EDTA 抗原修复溶液浸润脱蜡和水合石蜡样品。将样品煮沸 20 至 30 分钟，然后用去离子水洗涤并在 PBST 中孵育 5 分钟。用新鲜制备的0.3%过氧化氢溶液将样品浸泡15分钟，并用PBST洗涤3次，每次5分钟。

用 0.3% Triton 100 溶液透化标本膜 15 分钟，并用 30 至 40 μL 5% 牛血清白蛋白或 BSA 封闭 1 小时。除去封闭液后，加入适当稀释的一抗NF-kappa B和CD-68，并将标本在显微镜载玻片IHC湿箱中以2至8摄氏度孵育过夜。第二天，将样品转移到室温下一小时后，用PBST洗涤3次，每次5分钟。

在室温下将样品在兔抗小鼠辣根过氧化物酶标记的二抗中孵育一小时。孵育后，再次用PBST洗涤样品三次，每次5分钟，然后将样品与酶标记抗体对应的DAB底物孵育5至20分钟。用去离子水淬灭反应后，用魏格特苏木精对样品复染 30 秒。

在流水下冲洗一分钟，脱水，清除并密封组织。在进行蛋白质印迹分析之前，使用手持式电动研磨机在冰上用RIPA工作溶液匀浆组织5分钟。在冰上摇动孵育一小时，并将匀浆以 14， 800 G 离心 15 分钟，温度为 4 摄氏度。

收集上清液，并用BCA蛋白测定试剂盒测定蛋白质浓度。向上清液中加入 20 微升 5X 上样缓冲液，然后在 100 摄氏度的金属浴中加热用 RIPA 制备的每微升 6 微克蛋白质储存溶液 20 分钟。在零下 80 摄氏度下将 100 微升等分试样的蛋白质溶液储存在每个试管中。

对于电泳，用 RIPA 裂解物将等分试样稀释至每微升 2 至 3 微克，然后每孔加入 20 微克样品以电泳凝胶。使用湿法将蛋白质转移到用甲醇预活化的 PVDF 膜上 20 秒，电流为 400 毫安，持续 1 至 2 小时。用PBST溶液洗涤膜五次，每次5分钟后，用5%BSA或脱脂牛奶封闭一小时。

将条带浸没在含有NF-κB和β肌动蛋白的一抗溶液中，并用5%BSA稀释。在2至8摄氏度下轻轻摇晃条带过夜，然后用PBST清洗。接下来，将试纸条孵育，首先在室温下在稀释的二抗中孵育一小时，轻轻摇动，然后用增强的化学发光显影剂孵育三分钟。

将条带暴露于凝胶成像仪 20 秒，并通过系统软件测量条带的灰度值以评估蛋白质水平。CSD的SEM图像显示颗粒形状不规则。天狼星红染色测量胶原沉积表明，暴露于CSD一个月后，小鼠肺纤维化的进展明显加速。

偏光显微镜显示三种不同类型的胶原纤维，其中红色显示的1型胶原纤维是矽肺的危险因素，但在载体组中未发现明显的纤维化。相应的纤维化评分也表明了这一点。CSD处理的小鼠肺组织的HE染色显示典型的二氧化硅结节，其特征是CSD吞噬后在中心液化坏死，周围有巨噬细胞包围。

Masson染色也显示结节富集CSD并伴有纤维化。CD-68的免疫组化染色进一步揭示了肺组织中巨噬细胞的广泛存在。偏振光显微镜显示，这些巨噬细胞摄入了CSD，导致严重的肺损伤。

免疫组化染色显示 NF-κ B 染色更高，表明 CSD 治疗组的炎症反应高于载体组。代表性蛋白质印迹也显示，CSD治疗的小鼠在肺NF-κB表达较高，两组间表达差异显著。为了避免呼吸道阻塞并促进呼吸恢复，必须在五秒钟后轻轻按摩小鼠的心脏区域 5 到 10 次。

该模型可以探索矽肺病的一些潜在机制，并帮助治疗药物筛选，同时建立剂量和持续时间等关键参数。该技术提供了一种方便、有效和经济的方法，可以将小鼠模型暴露在颗粒物中，无论这是否会增加细菌。监测小鼠行为可以帮助确定吸入颗粒物的潜在影响。