في نموذج السحار السيليسي للفأر الموصوف الناتج عن التسريب داخل الليزر لغبار السيليكا البلوري ، قام كل تعليق CSD عدة مرات بمحاكاة حدوث وتطور السحار السيليسي البشري إلى حد كبير. هذه الطريقة هي توفير الوقت وتوفير المستوى ، وكذلك عملية وفعالة. علاوة على ذلك ، لا يسبب أي إصابة ميكانيكية في الجهاز التنفسي العلوي بسبب العملية.
يمكن أيضا استخدام هذه الطريقة لإعداد نماذج مرضية للفيروسات والبكتيريا وما إلى ذلك. سيوضح الإجراء Hangbing Cao ، وهو طالب في درجة الماجستير من مختبري ، ماهر في إعداد نموذج فأر السحار السيليسي. ابدأ بتحضير غبار السيليكا البلوري أو CSD قبل يوم واحد على الأقل من إعطاء قطرات الأنف.
للقيام بذلك ، طحن السيليكا في هاون العقيق لمدة نصف ساعة. للتحقق من حجم الجسيمات وشكلها ، قم بإعداد العينة لمسح المجهر الإلكتروني أو SEM باستخدام شريط موصل لربط جزيئات السيليكون. باستخدام مجفف الشعر ، قم بتفجير الجسيمات غير الملتصقة بإحكام برفق قبل الشروع في التقاط الصورة.
بعد ذلك ، قم بخلط السيليكا المطحونة والمحلول الملحي المعقم بتركيز 20 ملليغرام لكل ملليلتر باستخدام شاكر بالموجات فوق الصوتية. أخيرا ، دوامة تعليق CSD المعدة لمدة 10 ثوان. إدارة 50 ميكرولتر من CSD إلى الفأر المخدر عن طريق التنقيط الأنفي لمدة أربع إلى ثماني ثوان.
عالج ماوس التحكم بكمية متساوية من المحلول الملحي ، ثم أمسك جسم الماوس براحة اليد ، واضغط على الجلد على الجزء الخلفي من الرقبة بالإبهام والسبابة أثناء تثبيت الأطراف الخلفية للفأر بالأصابع الأخرى. اضغط على منطقة ضربات قلب الماوس برفق بإصبع السبابة الآخر من خمس إلى 10 مرات لمدة خمس ثوان. سخني أنسجة الرئة المدمجة في البارافين على طبق ساخن عند 60 درجة مئوية لأكثر من أربع ساعات.
لإزالة الشمع وترطيب قسم البارافين ، انقع الشريحة في الزيلين لمدة 30 دقيقة مرتين ، ثم اغمس الشريحة بالتتابع لمدة خمس دقائق في كل منهما في الإيثانول اللامائي 95٪ 85٪ و 75٪ ، وأخيرا ، في الماء منزوع الأيونات ، ثم ضع الشريحة في دلو تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 10 دقائق قبل شطفها برفق تحت الماء الجاري لمدة خمس دقائق. اغمسه في دلو تلطيخ eosin لمدة 10 ثوان. بعد تجفيف العينة بنسبة 75٪ 85٪ 95٪ والإيثانول اللامائي لمدة خمس دقائق لكل منهما ، قم بمسح قسم الأنسجة عن طريق غمره في الزيلين لمدة خمس دقائق ، وختمه بحوالي 60 ميكرولترا من قطرات الراتنج المحايدة.
ضع شريحة الغطاء بعناية فوق القسم. بالنسبة لتلطيخ ماسون ، قم بتلطيخ عينات البارافين منزوعة الشمع والرطبة باستخدام الهيماتوكسيلين الطازج بنسبة 50٪ Weigert لمدة 10 دقائق ، ثم بعد نقع الأنسجة في تسييل الإيثانول الحمضي لمدة 10 ثوان ، اشطف الشريحة برفق بالماء الجاري لتزرق النوى. بعد ذلك ، قم بتلطيخ العينة بقطرات من محلول تلطيخ أحمر لمدة سبع دقائق ، واغسلها بمحلول عمل حمض الهيدروكلوريك بنسبة 30٪ لمدة دقيقة واحدة.
بعد غمس الشريحة في 95٪ كحول لمدة 20 ثانية ، قم بتجفيف العينة بالإيثانول اللامائي لمدة ثانية إلى ثلاث ثوان مرتين ، وكما هو موضح من قبل ، قم بمسح العينة وختمها. بالنسبة لتلطيخ سيريوس الأحمر ، تسلل إلى القسم منزوع الشمع والرطب لمدة ساعة واحدة باستخدام محلول تلطيخ سيريوس الأحمر ، ثم تلطيخ نوى الخلية لمدة ثماني إلى 10 دقائق بمحلول تلطيخ الهيماتوكسلين ماير. اشطفه برفق تحت الماء الجاري لمدة 10 دقائق قبل تجفيف الشريحة وتنظيفها وإغلاقها.
تسلل إلى عينة البارافين منزوعة الشمع والرطبة ب 30 ملليلتر من ثلاثة ملليغرام لكل ملليلتر من محلول استرجاع مستضد EDTA. قم بغلي العينة لمدة 20 إلى 30 دقيقة قبل غسلها بالماء منزوع الأيونات واحتضانها في PBST لمدة خمس دقائق. انقع العينة لمدة 15 دقيقة بمحلول بيروكسيد الهيدروجين الطازج 0.3٪ ، واغسلها ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBST.
قم باختراق غشاء العينة لمدة 15 دقيقة بمحلول 0.3٪ Triton 100 ، وكتلته باستخدام 30 إلى 40 ميكرولتر من 5٪ من ألبومين مصل الأبقار أو BSA لمدة ساعة واحدة. بعد إزالة محلول الحجب ، أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة بشكل مناسب NF-kappa B و CD-68 ، واحتضان العينة طوال الليل عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية في صندوق مبلل IHC منزلق مجهري. في اليوم التالي ، بعد نقل العينة إلى درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة ، اغسلها ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBST.
احتضان العينة لمدة ساعة واحدة في بيروكسيديز الفجل المضاد للأرانب المسمى الأجسام المضادة الثانوية في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، اغسل العينات مرة أخرى ثلاث مرات لمدة خمس دقائق لكل منها باستخدام PBST ، ثم احتضان العينة بركيزة DAB المقابلة للإنزيم المسمى بالجسم المضاد لمدة خمس إلى 20 دقيقة. بعد إخماد التفاعل بالماء منزوع الأيونات ، قم بتلطيخ العينة لمدة 30 ثانية باستخدام الهيماتوكسيلين من Weigert.
شطفه تحت الماء الجاري لمدة دقيقة واحدة ، وتجفيف ، ومسح ، وختم الأنسجة. قبل الشروع في تحليل اللطخة الغربية ، قم بتجانس الأنسجة باستخدام محلول عمل RIPA على الجليد لمدة خمس دقائق باستخدام مطحنة كهربائية محمولة باليد. احتضان لمدة ساعة واحدة على الجليد مع الهز ، وأجهزة الطرد المركزي المجانسة في 14،800 غرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية.
اجمع المادة الطافية ، وحدد تركيز البروتين باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA. أضف 20 ميكرولترا من مخزن التحميل المؤقت 5X إلى المادة الطافية ، ثم سخني ستة ميكروغرام لكل ميكرولتر من محلول تخزين البروتين المحضر باستخدام RIPA في حمام معدني عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بتخزين 100 ميكرولتر من محلول البروتين في كل أنبوب عند 80 درجة مئوية تحت الصفر.
بالنسبة للرحلان الكهربائي ، قم بتخفيف الحصص إلى 2 إلى 3 ميكروغرام لكل ميكرولتر باستخدام RIPA lysate ، ثم أضف 20 ميكروجراما من العينة لكل بئر لتشغيل الجل. انقل البروتين إلى غشاء PVDF المنشط مسبقا بالميثانول لمدة 20 ثانية باستخدام طريقة النقل الرطب مع تيار 400 مللي أمبير لمدة ساعة إلى ساعتين. بعد غسل الغشاء خمس مرات لمدة خمس دقائق لكل منها بمحلول PBST ، قم بحظره باستخدام 5٪ BSA أو الحليب منزوع الدسم لمدة ساعة واحدة.
اغمر الشرائط في محلول الأجسام المضادة الأساسي الذي يحتوي على NF-kappa B وبيتا أكتين المخفف بنسبة 5٪ BSA. رج الشرائط برفق طوال الليل عند درجتين إلى ثماني درجات مئوية قبل غسلها باستخدام PBST. بعد ذلك ، احتضان الشرائط ، أولا في الجسم المضاد الثانوي المخفف لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة مع اهتزاز لطيف ، ثم مع مطور التلألؤ الكيميائي المحسن لمدة ثلاث دقائق.
قم بتعريض الشريط لجهاز تصوير جل لمدة 20 ثانية وقم بقياس القيمة الرمادية للشريط لتقييم مستوى البروتين بواسطة برنامج النظام. أظهرت صور SEM ل CSD أن الجسيمات كانت غير منتظمة الشكل. أظهر تلطيخ سيريوس الأحمر الذي تم إجراؤه لقياس ترسب الكولاجين أن تطور التليف الرئوي في الفئران قد تسارع بشكل كبير عند التعرض ل CSD لمدة شهر واحد.
كشف الفحص المجهري المستقطب عن ثلاثة أنواع مختلفة من ألياف الكولاجين ، منها ألياف الكولاجين من النوع الأول الموضحة باللون الأحمر هي عامل خطر للإصابة بالسليط السيليسي ، ومع ذلك ، لم يتم العثور على تليف كبير في مجموعة المركبات. وقد أشير إلى ذلك أيضا من خلال درجات التليف ذات الصلة. أظهر تلطيخ أنسجة رئة الفأر المعالجة ب CSD عقيدات السيليكا النموذجية التي تتميز بنخر مسال بعد البلعمة من CSD في المركز المحاط بالبلاعم في الأطراف.
أظهر تلطيخ ماسون أيضا أن العقيدات كانت غنية ب CSD مصحوبة بالتليف. كشف تلطيخ الكيمياء المناعية ل CD-68 عن وجود واسع للبلاعم في أنسجة الرئة. أظهر الفحص المجهري الضوئي المستقطب أن هذه الضامة قد ابتلعت CSD ، مما تسبب في إصابة شديدة في الرئة.
أظهر تلطيخ الكيمياء الهيستولوجية المناعية تلطيخا أعلى ل NF-kappa B ، مما يشير إلى استجابة التهابية أعلى في المجموعة المعالجة ب CSD مقارنة بمجموعة المركبات. أظهرت اللطخة الغربية التمثيلية أيضا أن الفئران المعالجة ب CSD لديها تعبير NF-kappa B أعلى في الرئة ، وكان الفرق في التعبير بين المجموعتين كبيرا. لتجنب انسداد الجهاز التنفسي وتعزيز الانتعاش التنفسي ، يجب تدليك منطقة قلب الفأر بلطف من خمس إلى 10 مرات كما هو موضح بعد فترة خمس ثوان.
يمكن لهذا النموذج استكشاف بعض الآليات الأساسية لداء السيليكاتس والمساعدة في فحص الأدوية العلاجية ، إلى جانب وضع معايير حاسمة مثل الجرعة والمدة. توفر هذه التقنية وسيلة مريحة وفعالة واقتصادية لتعريض نماذج الفئران للجسيمات سواء كان ذلك يضيف البكتيريا. يمكن أن تساعد مراقبة سلوك الفئران في تحديد الآثار المحتملة لاستنشاق الجسيمات.
