En el modelo de silicosis de ratón descrito generado por la infusión intraláser de polvo de sílice cristalina, todas las suspensiones de CSD simularon varias veces la aparición y el desarrollo de la silicosis humana en gran medida. Este método ahorra tiempo y nivel, además de ser práctico y eficaz. Además, no causa lesiones mecánicas en el tracto respiratorio superior debido a la operación.
Este método también podría utilizarse para preparar modelos de enfermedades de virus, bacterias, etc. Quien demostrará el procedimiento será Hangbing Cao, un estudiante de maestría de mi laboratorio, experto en la preparación del modelo de ratón con silicosis. Comience preparando el polvo de sílice cristalina o CSD al menos un día antes de administrar los goteos nasales.
Para ello, muele sílice en un mortero de ágata durante media hora. Para comprobar el tamaño y la forma de las partículas, prepare la muestra para la microscopía electrónica de barrido o SEM utilizando cinta conductora para unir las partículas de silicio. Con un secador de pelo, sople suavemente las partículas que no estén firmemente adheridas antes de proceder a capturar la imagen.
A continuación, mezcle la sílice molida y la solución salina estéril a una concentración de 20 miligramos por mililitro utilizando un agitador ultrasónico. Finalmente, vórtese la suspensión de CSD preparada durante 10 segundos. Administrar 50 microlitros de CSD al ratón anestesiado a través de un goteo nasal durante cuatro a ocho segundos.
Trate el ratón de control con una cantidad igual de solución salina, luego sostenga el cuerpo del ratón con la palma de la mano, pellizque la piel de la parte posterior del cuello con el pulgar y el índice mientras fija las extremidades traseras del ratón con los otros dedos. Presione suavemente el área de latidos del corazón del mouse con el otro dedo índice de cinco a 10 veces durante cinco segundos. Calentar el tejido pulmonar incrustado en parafina en una placa caliente a 60 grados centígrados durante más de cuatro horas.
Para desparafinar e hidratar la sección de parafina, sumerja el portaobjetos en xileno durante 30 minutos dos veces, luego sumerja secuencialmente el portaobjetos durante cinco minutos cada uno en etanol anhidro al 95%, 85% y 75% y, finalmente, en agua desionizada, luego coloque el portaobjetos en el cubo de tinción de hematoxilina durante 10 minutos antes de enjuagar suavemente con agua corriente durante cinco minutos. Sumérjalo en el cubo de tinción de eosina durante 10 segundos. Después de deshidratar la muestra en etanol anhidro al 75%, 85% 95% y anhidro durante cinco minutos cada una, limpie la sección de tejido sumergiéndola en xileno durante cinco minutos y séllela con aproximadamente 60 microlitros de gotas de resina neutra.
Coloque con cuidado la corredera de la cubierta sobre la sección. Para la tinción de Masson, tiña las muestras de parafina desparafinadas e hidratadas con hematoxilina de Weigert al 50% recién preparada durante 10 minutos, luego, después de remojar el tejido en licuación de etanol ácido durante 10 segundos, enjuague el portaobjetos suavemente con agua corriente para azular los núcleos. A continuación, tiña la muestra con gotas de solución de tinción roja durante siete minutos y lávala con una solución de trabajo de ácido clorhídrico al 30% durante un minuto.
Después de sumergir el portaobjetos en alcohol al 95% durante 20 segundos, deshidrate la muestra con etanol anhidro durante uno a tres segundos dos veces y, como se demostró anteriormente, limpie y selle la muestra. Para la tinción con rojo Sirius, infiltre la sección desparafinada e hidratada durante una hora con la solución de tinción roja Sirius, luego tiña los núcleos celulares durante ocho a 10 minutos con la solución de tinción de hematoxlyn Mayer. Enjuáguelo suavemente con agua corriente durante 10 minutos antes de deshidratar, limpiar y sellar el portaobjetos.
Infiltrar la muestra de parafina desparafinada e hidratada con 30 mililitros de una solución de recuperación de antígeno EDTA de tres miligramos por mililitro. Hervir la muestra durante 20 a 30 minutos antes de lavarla con agua desionizada e incubarla en PBST durante cinco minutos. Remoje la muestra durante 15 minutos con una solución de peróxido de hidrógeno al 0,3 % recién preparada y lávela tres veces durante cinco minutos cada una con PBST.
Permeabilizar la membrana de la muestra durante 15 minutos con una solución de Triton 100 al 0,3% y bloquear con 30 a 40 microlitros de albúmina sérica bovina al 5% o BSA durante una hora. Después de retirar la solución de bloqueo, agregue los anticuerpos primarios NF-kappa B y CD-68 adecuadamente diluidos, e incube la muestra durante la noche a una temperatura de dos a ocho grados Celsius en una caja húmeda IHC de portaobjetos de microscopio. Al día siguiente, después de transferir la muestra a temperatura ambiente durante una hora, lávela tres veces durante cinco minutos cada una con PBST.
Incubar la muestra durante una hora en anticuerpos secundarios marcados con peroxidasa de rábano picante de conejo a temperatura ambiente. Después de la incubación, lavar las muestras nuevamente tres veces durante cinco minutos cada una con PBST, luego incubar la muestra con el sustrato DAB correspondiente al anticuerpo marcado con la enzima durante cinco a 20 minutos. Después de apagar la reacción con agua desionizada, contratiñir la muestra durante 30 segundos con hematoxilina de Weigert.
Enjuáguelo con agua corriente durante un minuto, deshidrate, limpie y selle el tejido. Antes de proceder al análisis de Western blot, homogeneice el tejido con la solución de trabajo RIPA en hielo durante cinco minutos utilizando una amoladora eléctrica de mano. Incubar durante una hora en hielo con agitación, y centrifugar el homogeneizado a 14.800 G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Recoja el sobrenadante y determine la concentración de proteínas con un kit de ensayo de proteínas BCA. Agregue 20 microlitros de tampón de carga 5X al sobrenadante, luego caliente la solución de almacenamiento de proteínas de seis microgramos por microlitro preparada con RIPA en un baño de metal a 100 grados centígrados durante 20 minutos. Almacene 100 alícuotas de microlitros de la solución proteica en cada tubo a menos 80 grados centígrados.
Para la electroforesis, diluya las alícuotas a dos o tres microgramos por microlitro con lisado RIPA, luego agregue 20 microgramos de muestra por pocillo para ejecutar el gel. Transfiera la proteína a una membrana de PVDF preactivada con metanol durante 20 segundos utilizando el método de transferencia húmeda con corriente de 400 miliamperios durante una o dos horas. Después de lavar la membrana cinco veces durante cinco minutos cada una con una solución de PBST, bloquee con BSA al 5% o leche desnatada durante una hora.
Sumerja las tiras en la solución primaria de anticuerpos que contiene NF-kappa B y beta actina diluida con BSA al 5%. Agite las tiras suavemente durante la noche a una temperatura de dos a ocho grados centígrados antes de lavarlas con PBST. A continuación, incube las tiras, primero en el anticuerpo secundario diluido durante una hora a temperatura ambiente con una suave agitación, y luego con revelador de quimioluminiscencia mejorado durante tres minutos.
Exponga la tira a un generador de imágenes en gel durante 20 segundos y mida el valor de gris de la tira para evaluar el nivel de proteína mediante el software del sistema. Las imágenes SEM de CSD mostraron que las partículas tenían una forma irregular. La tinción de rojo Sirius realizada para medir la deposición de colágeno mostró que la progresión de la fibrosis pulmonar en ratones se aceleró significativamente tras la exposición a CSD durante un mes.
La microscopía polarizante reveló tres tipos diferentes de fibras de colágeno, de las cuales las fibras de colágeno tipo uno que se muestran en rojo son un factor de riesgo para la silicosis, sin embargo, no se encontró fibrosis significativa en el grupo del vehículo. Esto también fue indicado por las respectivas puntuaciones de fibrosis. La tinción con HE del tejido pulmonar de ratón tratado con CSD mostró nódulos de sílice típicos caracterizados por necrosis licuada después de la fagocitosis de CSD en el centro rodeado de macrófagos en la periferia.
La tinción de Masson también mostró que los nódulos estaban enriquecidos con CSD acompañada de fibrosis. La tinción inmunohistoquímica de CD-68 reveló además la amplia presencia de macrófagos en el tejido pulmonar. La microscopía de luz polarizada mostró que estos macrófagos habían ingerido CSD, causando lesiones pulmonares graves.
La tinción inmunohistoquímica mostró una mayor tinción de NF-kappa B, lo que indica una mayor respuesta inflamatoria en el grupo tratado con CSD que en el grupo de vehículos. El Western blot representativo también mostró que los ratones tratados con CSD tenían una mayor expresión de NF-kappa B en el pulmón, y la diferencia en la expresión entre los dos grupos fue significativa. Para evitar la obstrucción respiratoria y promover la recuperación respiratoria, el área del corazón del ratón debe masajearse suavemente de cinco a 10 veces, como se demostró después de un período de cinco segundos.
Este modelo puede explorar algunos mecanismos subyacentes de la silicosis y ayudar a la detección terapéutica de fármacos, junto con el establecimiento de parámetros cruciales como la dosis y la duración. Esta tecnología ofrece un medio conveniente, efectivo y económico para exponer modelos de ratón a material particulado, ya sea que esto agregue bacterias. El monitoreo del comportamiento de los ratones puede ayudar a determinar los efectos potenciales de la inhalación de partículas.
