記載されたマウス珪肺症モデルでは、結晶シリカダストのレーザー内注入によって生成された、すべてのCSD懸濁液がヒト珪肺症の発生と発症を数回シミュレートしました。この方法は、時間の節約とレベルの節約であるだけでなく、実用的で効果的です。また、手術による上気道への機械的損傷を生じさせない。
この方法は、ウイルスや細菌などの疾患モデルの作成にも使用できます。手順を実演するのは、私の研究室の修士課程の学生で、珪肺症マウスモデルの準備に熟練しているHangbing Caoです。点鼻薬を投与する少なくとも1日前に、結晶性シリカダストまたはCSDを準備することから始めます。
これを行うには、瑪瑙乳鉢でシリカを30分間挽きます。粒子の大きさや形状を確認するには、走査型電子顕微鏡やSEM用に導電性テープでシリコン粒子を結合させ、試料を作製します。ヘアドライヤーを使用して、しっかりと結合していない粒子をそっと吹き飛ばしてから、画像のキャプチャに進みます。
次に、超音波シェーカーを使用して、粉砕シリカと滅菌生理食塩水を1ミリリットルあたり20ミリグラムの濃度で混合します。最後に、準備したCSD懸濁液を10秒間ボルテックスします。麻酔をかけたマウスに50マイクロリットルのCSDを点鼻薬で4〜8秒間投与します。
対照マウスを等量の生理食塩水で処理し、マウスの体を手のひらで持ち、親指と人差し指で首の後ろの皮膚をつまみ、他の指でマウスの後肢を固定します。もう片方の人差し指でマウスの心臓の鼓動部分を5〜10回、5秒間静かに押します。パラフィン包埋肺組織をホットプレート上で摂氏60度で4時間以上加熱します。
パラフィン切片を脱ワックスして水和させるには、スライドをキシレンに30分間2回浸し、次にスライドを無水95%85%および75%エタノールにそれぞれ5分間順次浸し、最後に脱イオン水に浸し、スライドをヘマトキシリン染色バケツに10分間入れてから、流水で5分間穏やかにすすぎます。エオシン染色バケツに10秒間浸します。サンプルを75%85%95%と無水エタノールでそれぞれ5分間脱水した後、キシレンに5分間浸漬して組織切片を除去し、約60マイクロリットルの中性樹脂滴で密封します。
カバースライドをセクションの上に慎重に置きます。Masson染色では、脱ワックスおよび水和パラフィンサンプルを新たに調製した50%Weigertヘマトキシリンで10分間染色し、次に組織を酸性エタノール液化に10秒間浸した後、流水でスライドを穏やかにすすぎ、核の青化を行います。次に、試料を赤色染色液の滴で7分間染色し、30%塩酸作動液で1分間洗浄します。
スライドを95%アルコールに20秒間浸した後、無水エタノールでサンプルを1〜3秒間2回脱水し、前に示したように、サンプルを透明化して密封します。シリウスレッド染色では、シリウスレッド染色液で脱ワックスおよび水和切片に1時間浸潤し、次にメイヤーヘマトキリン染色液で細胞核を8〜10分間染色します。流水で10分間静かにすすぎ、脱水し、取り除き、スライドを密封します。
脱ワックスおよび水和パラフィンサンプルに、30ミリリットル/ミリリットルの3ミリグラムのEDTA抗原賦活化溶液を浸潤します。サンプルを20〜30分間煮沸してから、脱イオン水で洗浄し、PBSTで5分間インキュベートします。調製したばかりの0.3%過酸化水素水溶液にサンプルを15分間浸し、PBSTで5分間ずつ3回洗浄します。
0.3%Triton 100溶液で検体の膜を15分間透過処理し、30〜40マイクロリットルの5%ウシ血清アルブミンまたはBSAで1時間ブロックします。ブロッキング溶液を除去した後、適切に希釈した一次抗体NF-κBおよびCD-68を添加し、顕微鏡スライドIHCウェットボックス内で2〜8°Cで検体を一晩インキュベートします。翌日、試料を室温に1時間移した後、PBSTで5分間ずつ3回洗浄する。
サンプルをウサギ抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体中で室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをPBSTでそれぞれ5分間、3回再度洗浄し、次に、酵素標識抗体に対応するDAB基質とサンプルを5〜20分間インキュベートします。脱イオン水で反応を急冷した後、ワイゲルトヘマトキシリンでサンプルを30秒間対比染色します。
流水で1分間すすぎ、脱水し、透明にし、組織を密封します。ウェスタンブロット分析に進む前に、ハンドヘルド電動グラインダーを使用して、氷上で5分間、RIPA作業溶液で組織をホモジナイズします。振とうしながら氷上で1時間インキュベートし、ホモジネートを14, 800Gで摂氏4度で15分間遠心分離する。
上清を採取し、BCAタンパク質アッセイキットでタンパク質濃度を測定します。上清に20マイクロリットルの5倍ローディングバッファーを加え、RIPAで調製した6マイクログラム/マイクロリットルのタンパク質保存溶液を100°Cの金属浴中で20分間加熱します。タンパク質溶液100マイクロリットルのアリコートを各チューブに摂氏マイナス80度で保管します。
電気泳動の場合は、アリコートをRIPAライセートで1マイクロリットルあたり2〜3マイクログラムに希釈し、ウェルあたり20マイクログラムのサンプルを添加してゲルを泳動させます。400ミリアンペアの電流で1〜2時間、湿式転写法を使用して、メタノールで20秒間事前に活性化されたPVDFメンブレンにタンパク質を移します。メンブレンをPBST溶液でそれぞれ5分間5回洗浄した後、5%BSAまたはスキムミルクで1時間ブロックします。
5%BSAで希釈したNF-κBとβアクチンを含む一次抗体溶液にストリップを浸します。ストリップを摂氏2〜8度で一晩静かに振ってから、PBSTで洗浄します。次に、ストリップを、希釈した二次抗体中で室温で1時間穏やかに振とうし、次に増強化学発光現像液で3分間インキュベートします。
ストリップをゲルイメージャーに20秒間曝露し、ストリップのグレー値を測定して、システムソフトウェアでタンパク質レベルを評価します。CSDのSEM画像は、粒子が不規則な形状であることを示しました。コラーゲン沈着を測定するために実施したシリウスレッド染色は、マウスの肺線維症の進行が1ヶ月間のCSD曝露で有意に加速されることを示しました。
偏光顕微鏡検査により、3種類のコラーゲン線維が明らかになり、そのうち赤色で示した1型コラーゲン線維は珪肺症の危険因子であるが、ビヒクル群では有意な線維化は認められなかった。これは、それぞれの線維症スコアによっても示されました。CSD処理したマウス肺組織のHE染色では、中心部のCSDが貪食された後、液化壊死を特徴とする典型的なシリカ結節が示され、周囲はマクロファージに囲まれていました。
Masson染色は、結節が線維化を伴うCSDで強化されていることも示しました。CD-68の免疫組織化学染色により、肺組織にマクロファージが広く存在することがさらに明らかになりました。偏光顕微鏡検査では、これらのマクロファージがCSDを摂取し、重度の肺損傷を引き起こしていることが示されました。
免疫組織染色では、より高いNF-κB染色が示され、CSD治療群ではビヒクル群よりも炎症反応が高いことが示されました。代表的なウェスタンブロットでは、CSD処理マウスは肺でのNF-κBの発現が高く、2つのグループ間の発現の差が有意であることも示されました。呼吸閉塞を回避し、呼吸の回復を促進するために、マウスの心臓領域は、5秒間後に示されているように、5〜10回穏やかにマッサージする必要があります。
このモデルは、珪肺症の根本的なメカニズムを探り、治療薬のスクリーニングを支援するとともに、投与量や期間などの重要なパラメータを確立することができます。この技術は、マウスモデルを粒子状物質に曝露するための便利で効果的で経済的な手段を提供します。マウスの行動を監視することは、粒子状物質を吸い込んだ場合の潜在的な影響を判断するのに役立ちます。
