크리스탈 실리카 분진의 레이저 내 주입에 의해 생성된 설명된 마우스 규폐증 모델에서 모든 CSD 현탁액은 인간 규폐증의 발생 및 발달을 여러 번 시뮬레이션했습니다. 이 방법은 시간을 절약하고 수준을 절약할 뿐만 아니라 실용적이고 효과적입니다. 또한, 수술로 인한 상부 호흡기에 기계적 손상을 일으키지 않습니다.
이 방법은 또한 바이러스, 박테리아 등의 질병 모델을 제조하는 데 사용할 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 규폐증 마우스 모델을 준비하는 데 능숙한 제 실험실의 석사 학년 학생인 Hangbing Cao입니다. 비강을 투여하기 최소 하루 전에 결정질 실리카 분진 또는 CSD를 준비하는 것으로 시작하십시오.
이렇게하려면 마노 모르타르에서 실리카를 30 분 동안 갈아줍니다. 입자 크기와 모양을 확인하려면 실리콘 입자를 결합하기 위해 전도성 테이프를 사용하여 주사 전자 현미경 또는 SEM을 위한 샘플을 준비합니다. 헤어 드라이어를 사용하여 이미지 캡처를 진행하기 전에 단단히 결합되지 않은 입자를 부드럽게 불어냅니다.
다음으로, 초음파 쉐이커를 사용하여 밀리리터당 20밀리그램의 농도로 분쇄된 실리카와 멸균 식염수를 혼합합니다. 마지막으로 준비된 CSD 서스펜션을 10초 동안 소용돌이칩니다. 마취된 쥐에게 50 마이크로리터의 CSD를 4-8초 동안 비강 점액을 통해 투여합니다.
대조군 쥐에게 같은 양의 식염수를 투여한 다음 손바닥으로 쥐의 몸통을 잡고 엄지와 검지로 목 뒤쪽 피부를 꼬집고 다른 손가락으로 쥐의 뒷다리를 고정합니다. 다른 검지 손가락으로 마우스의 심장 박동 부위를 5초간 5-10회 부드럽게 누릅니다. 파라핀이 박힌 폐 조직을 섭씨 60도의 열판에 4시간 이상 가열합니다.
파라핀 섹션을 왁스 해제하고 수화하려면 슬라이드를 크실렌에 30 분 동안 두 번 담근 다음 무수 95 % 85 % 및 75 % 에탄올에 각각 5 분 동안 슬라이드를 순차적으로 담그고 마지막으로 탈 이온수에 담근 다음 슬라이드를 헤마 톡실린 염색 양동이에 10 분 동안 넣고 흐르는 물에 5 분 동안 부드럽게 헹굽니다. 에오신 염색 양동이에 10초 동안 담그십시오. 샘플을 75%85%95% 및 무수 에탄올에서 각각 5분 동안 탈수한 후 자일렌에 5분 동안 담가 조직 부분을 청소하고 약 60마이크로리터의 중성 수지 방울로 밀봉합니다.
덮개 슬라이드를 섹션 위에 조심스럽게 놓습니다. Masson 염색의 경우 탈왁스 및 수화 된 파라핀 샘플을 갓 준비한 50 % Weigert의 헤마톡실린 린으로 10 분 동안 염색 한 다음 조직을 산성 에탄올 액화에 10 초 동안 담근 후 흐르는 물로 슬라이드를 부드럽게 헹구어 핵 청색을 만듭니다. 다음으로, 7 분 동안 빨간 염색 용액의 방울로 샘플을 염색하고, 30 % 염산 작동 용액으로 1 분 동안 세척하십시오.
슬라이드를 95% 알코올에 20초 동안 담근 후 샘플을 무수 에탄올로 1-3초 동안 두 번 탈수하고 이전에 설명한 대로 샘플을 투명하게 하고 밀봉합니다. 시리우스 레드 염색의 경우, 시리우스 레드 염색 용액으로 1시간 동안 탈왁스 및 수화 부분을 침투시킨 다음 Mayer 헤마톡슬린 염색 용액으로 8-10분 동안 세포핵을 염색합니다. 슬라이드를 탈수하고 청소하고 밀봉하기 전에 흐르는 물에 10분 동안 부드럽게 헹굽니다.
탈왁스 및 수화된 파라핀 샘플에 3밀리리터당 3밀리그램의 EDTA 항원 회수 용액 30밀리리터를 침투시킵니다. 샘플을 20-30분 동안 끓인 후 탈이온수로 세척하고 PBST에서 5분 동안 배양합니다. 갓 준비한 0.3% 과산화수소 용액에 샘플을 15분 동안 담그고 PBST로 각각 5분씩 3회 세척합니다.
0.3 % Triton 100 용액으로 15 분 동안 검체의 막을 투과시키고 30-40 마이크로 리터의 5 % 소 혈청 알부민 또는 BSA로 1 시간 동안 차단합니다. 차단 용액을 제거한 후 적절하게 희석된 1차 항체 NF-kappa B 및 CD-68을 추가하고 현미경 슬라이드 IHC 습식 상자에서 섭씨 2-8도에서 밤새 검체를 배양합니다. 다음날 샘플을 실온에 1시간 동안 옮긴 후 PBST로 각각 5분씩 3회 세척합니다.
실온에서 토끼 항 마우스 양 고추 냉이 과산화 효소 표지 된 2 차 항체에서 샘플을 1 시간 동안 배양합니다. 배양 후, PBST로 각각 5분 동안 샘플을 다시 3회 세척한 다음, 효소 표지 항체에 해당하는 DAB 기질로 5-20분 동안 샘플을 배양합니다. 탈이온수로 반응을 담금질한 후 Weigert의 헤마톡실린으로 30초 동안 샘플을 대조염색합니다.
흐르는 물에 1분 동안 헹구고 탈수하고 깨끗이 씻은 다음 티슈를 밀봉합니다. 웨스턴 블롯 분석을 진행하기 전에 휴대용 전기 그라인더를 사용하여 얼음 위에서 5분 동안 RIPA 작업 용액으로 조직을 균질화합니다. 흔들면서 얼음 위에서 1시간 동안 배양하고, 14, 800 G에서 4°C에서 15분 동안 균질액을 원심분리한다.
상층액을 채취하고 BCA 단백질 분석 키트로 단백질 농도를 측정합니다. 상층액에 20 마이크로 리터의 5X 로딩 버퍼를 첨가 한 다음 RIPA로 제조 된 마이크로 리터 당 6 마이크로 그램의 단백질 저장 용액을 섭씨 100도의 금속 수조에서 20 분 동안 가열합니다. 단백질 용액 100마이크로리터를 섭씨 영하 80도의 각 튜브에 보관합니다.
전기영동을 위해 분취액을 RIPA 용해물로 마이크로리터당 2-3마이크로그램으로 희석한 다음 웰당 20마이크로그램의 샘플을 추가하여 겔을 실행합니다. 1-2시간 동안 400밀리암페어 전류의 습식 전달 방법을 사용하여 20초 동안 메탄올로 사전 활성화된 PVDF 멤브레인으로 단백질을 옮깁니다. PBST 용액으로 각각 5분씩 5회 세척한 후 5% BSA 또는 탈지유로 1시간 동안 차단합니다.
5% BSA로 희석한 NF-kappa B와 베타 액틴을 함유한 1차 항체 용액에 스트립을 담그십시오. 스트립을 섭씨 2도에서 8도에서 밤새 부드럽게 흔든 후 PBST로 씻습니다. 다음으로, 스트립을 먼저 희석된 2차 항체에 넣고 실온에서 1시간 동안 부드럽게 흔든 다음 강화된 화학발광 현상액으로 3분 동안 배양합니다.
스트립을 겔 이미저에 20초 동안 노출시키고 스트립의 회색 값을 측정하여 시스템 소프트웨어로 단백질 수준을 평가합니다. CSD의 SEM 이미지는 입자가 불규칙한 모양을 가지고 있음을 보여주었습니다. 콜라겐 침착을 측정하기 위해 수행된 Sirius 적색 염색은 마우스에서 폐 섬유증의 진행이 한 달 동안 CSD에 노출되었을 때 현저하게 가속화되었음을 보여주었습니다.
편광 현미경 검사에서 세 가지 유형의 콜라겐 섬유가 발견되었으며, 그 중 빨간색으로 표시된 1형 콜라겐 섬유는 규폐증의 위험 요소이지만 차량 그룹에서는 유의미한 섬유화가 발견되지 않았습니다. 이것은 또한 각각의 섬유증 점수에 의해 나타났다. CSD를 처리한 쥐 폐 조직의 HE 염색은 주변부의 대식세포로 둘러싸인 중앙에서 CSD의 식세포작용 후 액화 괴사를 특징으로 하는 전형적인 실리카 결절을 보여주었습니다.
Masson 염색은 또한 결절이 섬유증을 동반한 CSD로 풍부하다는 것을 보여주었습니다. CD-68의 면역조직화학 염색은 폐 조직에 대식세포가 광범위하게 존재한다는 것을 추가로 밝혀냈습니다. 편광 현미경 검사는 이러한 대식세포가 CSD를 섭취하여 심각한 폐 손상을 유발한다는 것을 보여주었습니다.
면역조직화학 염색은 NF-kappa B 염색이 더 높았으며, 이는 비히클 그룹보다 CSD 치료군에서 더 높은 염증 반응을 나타냈습니다. 대표적인 웨스턴 블롯은 또한 CSD를 처리한 마우스가 폐에서 NF-kappa B 발현이 더 높았으며 두 그룹 간의 발현 차이가 유의하다는 것을 보여주었습니다. 호흡 폐색을 피하고 호흡 회복을 촉진하려면 5초 후 입증된 대로 쥐의 심장 부위를 5-10회 부드럽게 마사지해야 합니다.
이 모델은 규폐증의 몇 가지 근본적인 메커니즘을 탐구하고 치료 약물 스크리닝을 돕고 투여량 및 기간과 같은 중요한 매개변수를 설정할 수 있습니다. 이 기술은 박테리아 추가 여부에 관계없이 마우스 모델을 미립자 물질에 노출시킬 수 있는 편리하고 효과적이며 경제적인 수단을 제공합니다. 쥐의 행동을 모니터링하면 미립자 물질 흡입의 잠재적 영향을 결정하는 데 도움이 될 수 있습니다.
