Этот простой в исполнении протокол оценивает антибактериальную эффективность различных комбинаций бактериофагов, также известных как фаговые коктейли, в различных условиях в условиях высокой пропускной способности. Основными преимуществами метода является способность передавать различные биотики и абиотические факторы, такие как температура, которые могут влиять на эффективность фагов в различных условиях окружающей среды. Этот метод может облегчить разработку соответствующих фаговых коктейлей для усиления биоконтроля и терапевтических результатов и определения взаимодействия между бактериальными хозяевами и бактериофагами.
Для начала настройте анализ микропластины с использованием отфильтрованных наконечников, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Сначала добавляют 180 микролитров mTSB в колодцы колонн от одной до 12 из 96-луночной микропластины, затем готовят последовательные десятикратные разбавления каждого фага в колоннах от одной до восьми стерильных 96-луночных микропластин для настройки анализа. Добавьте 20 микролитров отдельных фагов или фаговых коктейлей в колодцы от одного до восьми верхнего ряда А микропластины.
Для бесфагового и пустого контроля добавьте 20 микролитров mTSB в верхнюю скважину колонн с девяти до 12. Во время пипетки смешайте содержимое лунки с мягким и повторным аспирацией не менее пяти раз и меняйте наконечники между разведениями. Удалите 20 микролитров из последнего ряда H, затем создайте резервуар для испытуемого бактериального штамма, перенеся два-три миллилитра разбавленной культуры в резервуар с помощью одной миллилитровой пипетки.
Используя многоканальную пипетку, добавьте 20 микролитров разбавленной бактериальной культуры в каждую лунку в колонках от одного до 10, меняя наконечники между каждым добавлением. Накройте и высиживайте микропластинку при температуре 37 градусов Цельсия. С интервалом в два часа извлеките микропластинку из инкубатора и считайте пластину с помощью считывателя микропластин.
В качестве альтернативы, инкубируйте пластину в считывателе микропластин и считывайте ее с течением времени. Чтобы исследовать оптическую плотность на 600 нанометров с помощью считывателя микропластин, откройте программу на микропластинчатом считывателе. Выберите Простой режим в окне параметров запуска, а затем выберите Создать новый протокол в диспетчере задач.
В окне Выбор типа пластины выберите из раскрывающегося списка пластину с 96 лунками. В качестве метода обнаружения выберите «Поглощение» для типа считывания, выберите параметр «Конечная точка/кинетическая точка» для типа оптики, выберите «Монохроматоры» и нажмите кнопку «ОК». В поле Шаг чтения введите 600 нанометров для длин волн, выберите Нормальный для скорости считывания и нажмите OK.To установить температуру для анализа, установите флажок Инкубатор и выберите Инкубатор вкл.Введите желаемую температуру в поле температуры, а затем нажмите кнопку ОК. Нажмите на флажок Предварительный нагрев, прежде чем продолжить следующий шаг для температуры инкубации 37 градусов по Цельсию, хотя опция не требуется для условий испытаний при 22 градусах Цельсия. Чтобы предотвратить конденсацию на крышке пластины во время инкубации, установите градиент температуры, введя значение в поле градиента и нажмите кнопку ОК. Затем установите флажок Кинетический, чтобы открыть кинетическую установку.
Установите время выполнения на 10 часов для инкубации 37 градусов Цельсия или 22 часа для комнатной температуры и введите два часа в качестве интервала считывания, затем нажмите OK. Установите флажок Встряхнуть в окне процедуры, чтобы настроить условие встряхивания, если это необходимо для каждого кинетического чтения. Выберите Линейный режим в режиме встряхивания и измените длительность на 30 секунд. Установите значение линейной частоты равным 731 циклу в минуту, а затем щелкните OK.In диалоговом окне Сводка протокола, щелкните Макет пластины, выберите Пробелы, Элементы управления анализом и Образцы и нажмите кнопку Далее.
После определения настроек для каждого типа скважины нажмите кнопку Готово. Выберите идентификатор скважины в левом интерфейсе, назначьте его матрице, показанной в окне «Макет пластины», затем нажмите «ОК». Нажмите кнопку Read Plate, сохраните протокол в виде prt-файла и нажмите «Сохранить». Вставьте пластину и нажмите OK. После завершения эксперимента сохраните его в виде файла xpt и нажмите кнопку Сохранить.
Экспортируйте данные в Excel, нажав кнопку Да в окне окна сообщения для дальнейшего анализа. Нажмите на выбор Сохранить Да/Нет и установите флажок Не спрашивать снова, чтобы сохранить настройки. Следуя протоколу, было проведено сравнение эффективности фагов с различными комбинациями фагов, температурой, временем и множественностью инфекций или MOI.
Основываясь на этом анализе, эффективность фагов анти-O157 была максимизирована после 14, 16 или 18 часов инкубации при 22 градусах Цельсия. Для понимания кинетики бактерий, убивающей фаги, значения OD на уровне 600 нанометров были построены по времени отбора проб, MOI и обработке фагов. Показаны репрезентативные кривые роста бактерий при 37 градусах Цельсия.
T4 полностью ингибировал рост бактерий в каждый раз отбора проб даже при низком MOI. Чтобы проанализировать фаговы, ингибирующие рост бактерий, средние значения OD из всех MOI были построены по каждому времени отбора проб и обработке фагом. Репрезентативные графики при двух температурах показали, что эффективность уничтожения фагов, например, для T1 плюс T4 была повышена при 22 градусах Цельсия по сравнению с 37 градусами Цельсия.
Показано сравнение общей эффективности фагов, что облегчает определение наилучшей фазы лечения. Например, для штамма Escherichia coli 3081 лечение фагами Т4 и Т5 плюс Т4 было наиболее эффективным лечением при 37 градусах Цельсия. Однако при 22 градусах Цельсия, в дополнение к Т4, фаг Т1 плюс Т4, Т1 плюс Т4 плюс rV5 и четыре фаговых коктейля были эффективными.
При выполнении этой процедуры чрезвычайно точное пипетирование, особенно при использовании многоканальной пипетки, и единообразие подхода имеют важное значение для получения сопоставимых и интерпретируемых результатов. Последующие эксперименты необходимы для оценки дальнейшей эффективности наиболее влиятельного коктейля в скрининге, предотвращая появление антифаговых мутантов в обширной системе культивирования бульона и других биологических матрицах.
