Мы успешно использовали этот метод для создания мышиной модели, которая в большей степени соответствует патологическим изменениям атрезии желчевыводящих путей. Этот метод может имитировать симптомы острой и хронической атрезии желчевыводящих путей, что полезно для будущих исследований механизма заболевания. После использования антител время выживания мышей было увеличено, а симптомы облегчены, что свидетельствует о терапевтическом влиянии антител на атрезию желчевыводящих путей.
После разделения новорожденных мышей на разные группы, как описано в рукописи, предварительно обработайте каждую мышь внутрибрюшинной инъекцией пяти микрограммов антитела против Ly6G за четыре часа до инъекции резус-ротавируса или RRV для истощения Gr1-положительных клеток. В течение 24 часов после рождения внутрибрюшинно вводят новорожденной мыши 20 микролитров резус-ротавируса или физиологического раствора. После инъекции RRV введите 20 мкг антитела против Ly6G в брюшную полость мыши.
Ежедневно проверяйте и записывайте внешний вид, вес и выживаемость всех мышей. Для внутрибрюшинной инъекции обнажают живот молодой мыши, ущипнув кожу шеи указательным и большим пальцами одной руки и осторожно удерживая задние лапы мыши безымянным и хвостовым пальцами. Поднимите иглу шприца под наклоном вверх и введите иглу в среднее бедро правой задней ноги мыши под углом 15 градусов к коже.
Перемещая иглу по подкожной дорожке до тех пор, пока она не достигнет правого реберного края мыши, направьте иглу вниз в брюшную полость и введите жидкость под печень мыши. Вытащите иглу сразу после инъекции. Наблюдайте за кровотечением или подтеканием в месте инъекции.
После обезболивания мыши на 12-й день препарируйте ее под микроскопом. Вставьте инсулиновый шприц объемом один миллилитр в левый желудочек сердца для сбора крови. Центрифугируйте кровь в 400 г в течение пяти минут при комнатной температуре и отделяйте сыворотку для измерения функции печени.
Отделите печень и селезенку мыши от окружающих тканей с помощью ножниц и пинцета. Сфотографируйте общий вид печени и желчных протоков. После ингаляционной анестезии обнажить печень, желчный пузырь и внепеченочные желчные протоки ножницами и ватными палочками.
Под микроскопом позы введите от пяти до 10 микролитров флуоресцентного красителя Rhodamine 123 в желчный пузырь с помощью инсулинового шприца объемом в один миллилитр и сделайте снимки. Погрузите свежую ткань печени мыши в 10% формалин на 24 часа. После того, как ткань будет погружена в парафин, используйте парафиновый микротом, чтобы разрезать парафиновый блок на участки толщиной четыре микрометра, и поместите два последовательных участка на одно и то же предметное стекло.
Затем поместите ломтики в решетку для нарезки, очистите их от парафина в ксилоле и последовательно увлажните их в абсолютном этаноле, 95% этаноле, 80% этаноле, 70% этаноле и дистиллированной воде в течение пяти минут каждый. Окрашивайте срезы раствором гематоксилина в течение пяти минут и замочите их в 1%-ной соляной кислоте и 75%-ном спирте на пять секунд. Промыв срезы чистой водой, испачкайте их раствором эозина в течение одной минуты.
Подготовьте срезы тканей к окрашиванию, как показано ранее, и выполните репарацию антигена с помощью буфера Tris-EDTA. Нагрейте срезы в микроволновой печи при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут, затем выньте и остудите их естественным путем до комнатной температуры. Чтобы удалить эндогенную пероксидазу, поместите срезы ткани в 3%-ную перекись водорода на 10 минут и обработайте срезы 5%-ной козьей сывороткой, чтобы блокировать неспецифическое связывание.
Затем добавьте в срезы первичное антимышиное цитокератин 19 крысы или моноклональное антитело F4/80 против крыс и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Инкубируйте срезы с соответствующими вторичными антителами в течение 30 минут при комнатной температуре. Используйте 3, 3-прайм-диаминобензидин в качестве хромогенного агента для наблюдения за хромогенной реакцией под микроскопом.
Наблюдайте за срезами под 40-кратным микроскопом, чтобы получить изображения и проанализировать их по мере необходимости. После того, как срезы ткани подготовлены и окрашены гематоксилином, покройте каждую ткань 50 микролитрами красного раствора красителя сириуса при комнатной температуре в течение одного часа. Высушите предметные стекла естественным путем при комнатной температуре в течение четырех часов, добавьте каплю нейтральной жевательной резинки на каждое предметное стекло и используйте покровное стекло, чтобы покрыть ткань, чтобы избежать пузырей.
Оставьте предметные стекла при комнатной температуре на 24 часа, чтобы нейтральная резинка затвердела. Наблюдайте за деталями осаждения коллагена с помощью поляризованной контрастной световой микроскопии. Выберите четкое и подходящее поле зрения и отрегулируйте яркость и баланс белого поля зрения микроскопа.
Получайте изображения и анализируйте их по мере необходимости под 40-кратным микроскопом. После инъекции RRV среднее время выживания в группе RRV составило 13 дней. У большинства мышей, получавших антитела, развилась легкая желтуха, и потери веса не наблюдалось.
Печень мышей БА показала некротические поражения и внепеченочный сегмент атрезии желчных протоков. Размер печени меньше, чем в контрольной группе. Гистологический анализ показал, что терапия низкими дозами анти-Ly6G уменьшила воспаление воротной вены.
Воспалительное накопление клеток все еще наблюдалось в срезах ткани печени на 42-й день. На 12-е сутки наблюдалось незначительное увеличение отложения коллагена в портальной области. На 42-й день экспрессия коллагена была значительно увеличена, и в ткани БА наблюдалось значительное отложение коллагена.
CK19-положительные клетки наблюдались на 12-й день. На 42-й день количество CK19-положительных клеток увеличилось, но зрелых желчных протоков было мало. Внепеченочный желчный проток у хронических мышей БА был заблокирован и имел воспалительные инфильтраты микрофагов.
Уровни АЛТ и ЩФ в печени были выше в группе хронической БА, чем в нормальной контрольной группе. Уровни общего билирубина, прямого билирубина и непрямого билирубина были увеличены, что указывает на то, что функция печени была значительно снижена в стадии хронического фиброза БА. Инъекцию следует делать с осторожностью, чтобы не проколоть печень мыши. После инъекции мы должны около 10 секунд наблюдать за состоянием мыши и очищать рану от крови.
