Общая цель этих процедур заключается в скрининге ингибиторов репликации вируса Зика в высокопроизводительном формате скрининга с использованием анализа на основе репликона и/или вирусных ферментов. Открытие противовирусных препаратов требует разработки надежных клеточных и биохимических анализов, которые могут быть выполнены в высокопроизводительных форматах скрининга. Скрининг на основе репликона и анализы на основе вирусных ферментов являются двумя ценными стратегиями тестирования маломолекулярных соединений в качестве ингибиторов вируса Зика.
Репликоны представляют собой самовоспроизводящиеся субгеномные системы, экспрессируемые в клетках млекопитающих, в которых вирусные структурные гены заменяются репортерным геном. В нашей лаборатории мы разработали систему репликакона вируса Зика, включая люциферазу Renilla, которая стабильно экспрессируется в клеточных линиях BHK-21. Ингибирующее воздействие соединений на репликацию вирусной РНК можно легко оценить, измерив снижение активности люциферазы.
Чтобы охарактеризовать конкретные мишени идентифицированных соединений, мы установили анализы на основе флуоресценции in vitro для рекомбинантно экспрессированной протеазы NS3 и NS5 РНК-зависимой РНК-полимеразы, RdRp. Начните с культивирования вирусных репликонов Зика, пока они не достигнут 70-90-процентного слияния. В стерильном ламинаре выньте и выбросьте мочку из колбы.
Добавьте пять мил трипсина-ЭДТА в колбу. Распределите раствор трипсина по клеткам и оставьте колбу на пять-10 минут, чтобы клетки отсоединиться. Соберите повторно суспендированные клетки и поместите их в стерильную 50-мильную трубку и центрифугируют ее для 125G в течение пяти минут.
После выброса супернатанта повторно суспендировали клетки в пяти милях DMEM 10% FBS для подсчета. Отрегулируйте ячейки до двух раз по 10-четыре в колодец и посейте их в 96-скважинную пластину. Затем инкубируют пластину в течение 16 часов при 37 градусах Цельсия в инкубаторе увлажнителя CO2.
Далее отбросьте среду и добавьте 100 микролитров на лунку DMEM 2%FBS. Добавляют один микролитр соединения на лунку, чтобы получить конечную концентрацию 10 микромоляров и 1% ДМСО в пробирной среде. В первой и в последней колонке подготовьте положительный и отрицательный контроль.
Инкубировать пластину в течение 48 часов при 37 градусах Цельсия в инкубаторе увлажнителя CO2. Готовят буфер лизиса люциферазы Renilla в реагенте в соответствии с инструкцией по изготовлению. После выброса супернатанта из клеток добавляют 25 микролитров буфера люциферазы Ренилла на лунку.
Добавьте 100 микролитров реагента для анализа люциферазы Renilla на лунку в белую непрозрачную 96-луночную пластину. Перенесите 20 микролитров лизата ячейки на белую пластину, а затем считывание сигналов люминесценции в люминометре. Для анализа MTT процедура ранее продемонстрировала и после инкубации соединения добавляет 10 микролитров на лунку раствора MTT к клеткам и инкубирует пластину при 37 цельсиях в увлажнителе CO2 в течение 24 часов.
Выбросьте супернатант и добавьте 100 микролитров ДМСО в каждую лунку, а затем солюбилизируйте кристаллы формазана путем пипетирования вверх и вниз. Считывание абсорбентов на 570 нанометрах в спектрофотометре. После оттаивания материалов на льду приготовьте соответствующее количество разбавления белка, чтобы достичь конечной концентрации в четыре наномоляра на скважину.
В 96-луночную белую пластину дозируют 84 микролитра буфера анализа в каждой лунке. Чтобы подготовить контрольную реакцию, добавьте один микролитр ДМСО в первую колонку пластины. Добавьте один микролитр истрируемых соединений, чтобы достичь конечной концентрации 10 микромоляров к пластине.
Дозируйте пять микролитров на лунку раствора протеазы, исключая контроль, и инкубируйте пластину при четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. Для начала реакции дозируют в скважины 10 микролитров раствора фторогенного субстрата. Следите за их реакцией с помощью флуорометра, заданного по соответствующим параметрам.
Для этого сеанса все реагенты должны быть подготовлены с водой, обработанной DEPC. Отжиг РНК полиуридина путем инкубации его при 55 градусах Цельсия в течение пяти минут в термоциклере. Разморозить материалы на льду и разбавить белок до достижения конечной концентрации 250 наномоляров в буфере анализа.
Подготовьте буфер анализа раствора SYBR Green I, а затем добавьте АТФ и оживленные РНК до конечной концентрации одного миллимоляра и 300 наномоляров соответственно. В пластину ПЦР добавляют 24,5 микролитра разбавленного белка в колонках от одного до 11. Добавьте такой же объем буфера анализа в оставшиеся скважины.
Добавьте 0,5 микролитра на лунку соединений и контроля, чтобы достичь конечной концентрации 10 микромоляров. После 15 минут инкубации начинают реакцию, добавляя 25 микролитров раствора подложки и запечатывая пластину. Следите за реакцией в системе ПЦР в режиме реального времени, инкубированной при 30 градусах Цельсия с использованием фильтра FAM.
На рисунке 1А мы видим схематическое представление конструкции РНК, разработанной для получения клеточных линий вирусного репликакона Зика, показывающее, что ген Rluc заменяет структурные последовательности, а новая кассета IRES вставлена на 3'end. Он также включает промотор Т7 в последовательности рибозима дельта-вируса гепатита для транскрипции in vitro и для генерации аутентичного 3'end и транскрипта РНК соответственно. На рисунке 1B мы видим схематическое представление анализа клеток на основе replicon.
На рисунке 1С мы видим кривые доза-реакция и кривые цитотоксичности данного соединения, полученные с использованием системы репликона Рлука. На рисунке 2А мы видим схематическое представление анализа, используемого для определения активности протеазы NS2B-NS3. На рисунке 2B мы видим кривую доза-реакция данного ингибитора, нацеленного на протеазу NS2B-NS3.
На рисунке 2C мы видим схематическое представление анализа удлинения, используемого для определения активности NS5 RdRp. На рисунке 2D мы видим группу «доза-реакция» данного ингибитора, нацеленную на активность RdRp вируса Зика. Продемонстрированные процедуры могут быть легко адаптированы для скрининга в форматах 384 или 1, 536 скважин.
Для высокопроизводительных скринингов на основе репликона мы разработали стабильную клеточную линию, содержащую репликативный репликон вируса Зика, содержащий последовательность люциферазы Renilla на 5'end, а также ген неомицинфосфотрансферазы, управляемый внутренним рибосомным входом на 3'end. Из-за отсутствия структурных генов репликоны не продуцируют вирионы потомства. Таким образом, исключается риск лабораторно приобретенной вирусной инфекции.
Кроме того, мы также продемонстрировали процедуры, используемые в анализах на основе вирусных ферментов для рекомбинантной протеазы NS3 и NS5 RdRp. Протеолитическую активность вирусной протеазы измеряли с помощью фторогенного пептидного субстрата, который содержит последовательности распознавания и расщепления протеазы вируса Зика в сочетании с флуоресцентным запасом аминометилкумарина. Что касается NS5 РНК-зависимой РНК-полимеразы, ее активность удлинения непосредственно обнаруживается увеличением флуоресцентного сигнала SYBR Green I. Эти реализации, прямое измерение и доступность являются ключевыми моментами для методов пользователя, основанных на флуоресценции, в качестве высокопроизводительных скрининговых платформ.
