Наши исследования сосредоточены на свойствах и функциях мембранного транспорта, в частности, ионных транспортеров и каналов, таких как LRRC8-образованные анионные и осмолитные каналы. Мы исследуем их биофизические механизмы, регуляторные процессы и физиологические функции клеток. В конце концов, мы также стремимся выяснить, как их дисфункция может привести к расстройствам у людей.
Многие лаборатории углубили наше понимание каналов LRRC, разрешения структур комплексов LRRC8, выяснения электрофизиологических свойств и раскрытия различных физиологических ролей. Тем не менее, остается важный вопрос: как эти каналы биохимически и физиологически регулируются и как состав субъединиц влияет на их активацию и роль в клетке? Этот метод позволяет наблюдать активность канала LRRC8 в компартментах, обычно недоступных для электрофизиологии, таких как внутриклеточные компартменты, без нарушения цитозольного состава, как это было бы при патч-зажиме для всей клетки.
Его субклеточное разрешение позволяет контролировать дифференциально активируемые каналы LRRC8 в пределах одной клетки и обеспечивает непрерывный мониторинг физиологических процессов. С помощью этого датчика на основе FRET мы будем исследовать регуляцию и функционирование каналов LRRC8 VRAC в различных физиологических условиях. Ключевые вопросы: как субъединицы переставляют свое подтверждение; какие процессы передачи сигнала связаны с различными стимулами, и есть ли различия между различными паралогами LRRC8; и есть ли субклеточные различия в физиологических процессах.
Для начала подготовьте изотонический, гипотонический и гипертонический буферы. С помощью осмометра измерьте осмолярность буфера. За день до трансфекции засейте один умножить на десять в степени пяти клеток HeLa в два миллилитра клеточной питательной среды на 35-миллиметровой посуде.
Культивируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день по каплям добавьте в посуду раствор для трансфекции спиральными движениями. Переместите чашку пять раз по горизонтали и вертикали по поверхности скамейки, чтобы перемешать раствор.
Культивируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день проверьте трансфекцию под флуоресцентным микроскопом. Возьмите клетки, экспрессирующие как донорскую, так и акцепторную конструкции, и аспирируйте среду для клеточной культуры.
Промойте клетки трижды двумя миллилитрами изотонического буфера. После аспирации изотонического буфера добавьте в клетки три миллилитра изотонического буфера и поместите чашку с образцом на предметный столик микроскопа. Загрузите настройки FRET в микроскопии или настройте необходимые каналы для эксперимента FRET: возбуждение донора-донорская эмиссия, DD; донор-акцептор, DA; и акцептор-акцептор, АА. Найдите поле зрения, в котором есть хотя бы одна ячейка, выражающая как донорскую, так и акцепторную конструкции, и при необходимости скорректируйте настройки канала.
Снимите пластину с предметного столика микроскопа и поместите ее обратно в инкубатор до начала эксперимента. Возьмите клетки, экспрессирующие только донорский конструкт, и аспирируйте питательную среду. Промойте клетки трижды двумя миллилитрами изотонического буфера.
После последней промывки добавьте в клетки три миллилитра изотонического буфера и поставьте чашку с образцом на предметный столик микроскопа. Найдите поле зрения, в котором есть хотя бы одна клетка, экспрессирующая донорскую конструкцию. Изобразите все каналы донор-донор, акцептор-акцептор и донор-акцептор.
Нарисуйте область интереса или ROI вокруг клеток и измерьте среднюю интенсивность каналов донор-акцептор и донор-донор. Для вычитания фона нарисуйте ROI в каналах донор-акцептор и донор-донор, где найден только фоновый сигнал, и измерьте среднюю интенсивность. После визуализации клеток нарисуйте ROI вокруг клеток и измерьте среднюю интенсивность канала донор-акцептор и акцептор-акцептор.
Для вычитания фона нарисуйте ROI в каналах донор-акцептор и акцептор-акцептор, где найден только фоновый сигнал, и измерьте среднюю интенсивность. Наконец, рассчитайте поправочные коэффициенты, бета и гамма, используя значения, определенные для IDA с коррекцией фона, IDD с коррекцией фона и IAA с коррекцией фона. Для начала необходимо аспирировать буфер из ранее подготовленных клеток HeLa, экспрессирующих донора и акцептора.
Промойте клетки тремя миллилитрами изотонического буфера и поставьте чашку с образцом на предметный столик микроскопа. Для аспирации изотонического буфера закрепите и отрегулируйте канюлю для шланга так, чтобы ее кончик достигал дна посуды. Для добавления буферов зафиксируйте и отрегулируйте трубки так, чтобы буферный поток, управляемый действием силы тяжести, попадал в чашку.
Найдите поле зрения, в котором хотя бы одна клетка одновременно выражает донорскую и акцепторную конструкцию, и получите изображение. Для фонового вычитания сигнала FRET нарисуйте ROI в канале донор-акцептор, где найден только фоновый сигнал, и измерьте среднюю интенсивность. Для количественного определения SE-FRET нарисуйте ROI вокруг ячейки и измерьте среднюю интенсивность в каналах донор-донор, донор-акцептор и акцептор-акцептор для всех изображений во временном ряду.
Настройте покадровый эксперимент для каналов донор-донор, донор-акцептор и акцептор-акцептор с интервалом 10 секунд и длительностью для охвата всех условий последовательности стимуляции. Начните получение покадровой съемки и постройте график трасс SE-FRET. После базового измерения замените буфер на гравитационный поток.
В эксперименте в реальном времени отсасывайте изотонический буфер через канюлю шланга, создавая вакуум с помощью шприца. Добавьте три миллилитра буфера следующего состояния под действием силы тяжести, продолжая покадровую съемку. Чтобы измерить другое условие, промойте образец в следующем буфере, как показано ранее, продолжая покадровую съемку.
С помощью метода, основанного на FRET, контролировали активность регулируемого по объему анионного канала LRRC8 во время осмотической стимуляции, и снижение SE-FRET коррелировало с внеклеточным гипотонизмом. В других экспериментах также была обнаружена активация LRRC8 VRAC изосмотическими стимулами, такими как передача сигналов диацилглицерина или активация миоцитов. Активность LRRC8 VRAC контролировали при индукции апоптоза в клетках HeLa, экспрессирующих LRRC8A mCerulean3 и LRRC8E mVenus.
Фактор некроза опухоли альфа и циклогексимид вызывали стойкое снижение SE-FRET, которое восстанавливалось в гипертонической среде. Лечение ДМСО не снижало SE-FRET, что подтверждает специфичность LRRC8 VRAC.
