Unsere Forschung konzentriert sich auf die Eigenschaften und Funktionen des Membrantransports, insbesondere auf Ionentransporter und Kanäle wie LRRC8-gebildete Anionen- und Osmolytkanäle. Wir untersuchen ihre biophysikalischen Mechanismen, Regulationsprozesse und zellphysiologischen Funktionen. Letztendlich wollen wir auch aufklären, wie ihre Funktionsstörung zu Störungen beim Menschen führen kann.
Viele Labore haben unser Verständnis von LRRC-Kanälen erweitert, die Strukturen von LRRC8-Komplexen aufgeklärt, elektrophysiologische Eigenschaften aufgeklärt und verschiedene physiologische Rollen aufgedeckt. Eine entscheidende Frage bleibt jedoch: Wie werden diese Kanäle biochemisch und physiologisch reguliert und wie beeinflusst die Zusammensetzung der Untereinheiten ihre Aktivierung und Rolle innerhalb der Zelle? Diese Methode ermöglicht die Beobachtung der LRRC8-Kanalaktivität in Kompartimenten, die für die Elektrophysiologie typischerweise unzugänglich sind, wie z. B. intrazelluläre Kompartimente, ohne die zytosolische Zusammensetzung zu stören, wie es bei Ganzzell-Patch-Clamps der Fall wäre.
Seine subzelluläre Auflösung ermöglicht die Überwachung von differentiell aktivierten LRRC8-Kanälen innerhalb einer einzelnen Zelle und ermöglicht eine kontinuierliche Überwachung während physiologischer Prozesse. Mit diesem FRET-basierten Sensor werden wir die Regulation und Funktion von LRRC8 VRAC-Kanälen unter verschiedenen physiologischen Bedingungen untersuchen. Schlüsselfragen sind: wie die Untereinheiten ihre Bestätigung neu anordnen; welche Signaltransduktionsprozesse an verschiedenen Stimuli beteiligt sind und ob es Unterschiede zwischen den verschiedenen Parametern von LRRC8 gibt; und ob es subzelluläre Unterschiede in den physiologischen Prozessen gibt.
Bereiten Sie zunächst die isotonischen, hypotonen und hypertonen Puffer vor. Messen Sie mit einem Osmometer die Osmolarität des Puffers. Am Tag vor der Transfektion säen Sie eine mal zehn hoch fünf HeLa-Zellen in zwei Millilitern Zellkulturmedium auf einer 35-Millimeter-Schale.
Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag tropfenweise die Transfektionslösung in spiralförmigen Bewegungen in die Schale geben. Bewegen Sie die Schale fünfmal horizontal und vertikal auf der Oberfläche der Bank, um die Lösung zu mischen.
Kultivieren Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Überprüfen Sie am nächsten Tag die Transfektion unter einem Fluoreszenzmikroskop. Nehmen Sie die Zellen, die sowohl das Donor- als auch das Akzeptorkonstrukt exprimieren, und aspirieren Sie das Zellkulturmedium.
Waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei Millilitern isotonischem Puffer. Nach dem Aspirieren des isotonischen Puffers geben Sie drei Milliliter isotonischen Puffer in die Zellen und stellen Sie die Probenschale auf den Mikroskoptisch. Laden Sie die FRET-Einstellungen für die Mikroskopie oder richten Sie die erforderlichen Kanäle für ein FRET-Experiment ein:Donoranregung-Donor-Emission, DD;Donor-Akzeptor, DA; und Akzeptor-Akzeptor, AA. Suchen Sie ein Sichtfeld mit mindestens einer Zelle, die sowohl das Donor- als auch das Akzeptorkonstrukt exprimiert, und passen Sie die Kanaleinstellungen bei Bedarf an.
Nehmen Sie die Platte vom Mikroskoptisch und legen Sie sie bis zum Experiment wieder in den Inkubator. Nehmen Sie die Zellen, die nur das Spenderkonstrukt exprimieren, und aspirieren Sie das Kulturmedium. Waschen Sie die Zellen dreimal mit zwei Millilitern isotonischem Puffer.
Geben Sie nach dem letzten Waschen drei Milliliter isotonischen Puffer in die Zellen und stellen Sie die Probenschale auf den Mikroskoptisch. Finde ein Sichtfeld mit mindestens einer Zelle, die das Spenderkonstrukt exprimiert. Stellen Sie sich alle Donor-Donor-, Akzeptor-Akzeptor- und Donor-Akzeptor-Kanäle vor.
Zeichnen Sie einen Bereich of Interest oder ROI um die Zellen und messen Sie die mittlere Intensität von Donor-Akzeptor- und Donor-Donor-Kanälen. Für die Hintergrundsubtraktion zeichnen Sie einen ROI in den Donor-Akzeptor- und Donor-Donor-Kanälen, in denen nur das Hintergrundsignal zu finden ist, und messen Sie die mittlere Intensität. Zeichnen Sie nach der Bildgebung der Zellen einen ROI um die Zellen und messen Sie die mittlere Intensität des Donor-Akzeptors und des Akzeptor-Akzeptor-Kanals.
Für die Hintergrundsubtraktion zeichnen Sie einen ROI in den Donor-Akzeptor- und Akzeptor-Akzeptor-Kanälen, in denen nur das Hintergrundsignal zu finden ist, und messen Sie die mittleren Intensitäten. Berechnen Sie abschließend die Korrekturfaktoren Beta und Gamma unter Verwendung der Werte, die für die hintergrundkorrigierte IDA, die hintergrundkorrigierte IDD und die hintergrundkorrigierte IAA ermittelt wurden. Zu Beginn aspirieren Sie den Puffer aus den zuvor vorbereiteten HeLa-Zellen, die den Donor und den Akzeptor exprimieren.
Waschen Sie die Zellen mit drei Millilitern isotonischem Puffer und stellen Sie die Probenschale auf den Mikroskoptisch. Zum Absaugen des isotonischen Puffers befestigen Sie eine Schlauchkanüle und stellen Sie sie so ein, dass ihre Spitze den Boden der Schale erreicht. Um Puffer hinzuzufügen, fixieren und passen Sie die Schläuche so an, dass der durch die Schwerkraft angetriebene Pufferfluss in die Schale fallen kann.
Finden Sie ein Sichtfeld mit mindestens einer Zelle, die das Donor- und Akzeptorkonstrukt gleichzeitig exprimiert, und nehmen Sie ein Bild auf. Für die Hintergrundsubtraktion des FRET-Signals zeichnen Sie einen ROI im Donor-Akzeptor-Kanal, wo nur das Hintergrundsignal zu finden ist, und messen Sie die mittlere Intensität. Für die SE-FRET-Quantifizierung zeichnen Sie einen ROI um die Zelle und messen Sie die mittlere Intensität in den Donor-Donor-, Donor-Akzeptor- und Akzeptor-Akzeptor-Kanälen für alle Bilder in der Zeitreihe.
Richten Sie ein Zeitrafferexperiment für die Kanäle Donor-Donor, Donor-Akzeptor und Akzeptor-Akzeptor mit einem Intervall von 10 Sekunden und einer Dauer ein, die alle Bedingungen der Stimulationssequenz abdeckt. Starten Sie die Aufnahme der Zeitrafferaufnahme und zeichnen Sie die SE-FRET-Spuren auf. Ersetzen Sie nach der Basismessung den Puffer durch Schwerkraftströmung.
Im Live-Experiment aspirieren Sie den isotonischen Puffer über die Schlauchkanüle und legen mit einer Spritze ein Vakuum an. Fügen Sie drei Milliliter des Puffers der nächsten Bedingung durch Schwerkraft hinzu, während Sie die Zeitrafferbildgebung fortsetzen. Um eine andere Bedingung zu messen, waschen Sie die Probe wie zuvor gezeigt im nächsten Puffer, während Sie die Zeitrafferbildgebung fortsetzen.
Mit der FRET-basierten Methode wurde die Aktivität des volumenregulierten LRRC8-Anionenkanals während der osmotischen Stimulation überwacht und die SE-FRET-Reduktion korrelierte mit der extrazellulären Hypotonie. In anderen Experimenten wurde auch die Aktivierung von LRRC8 VRAC durch isosmotische Stimuli wie Diacylglycerin-Signalweg oder Myozytenaktivierung nachgewiesen. Die VRAC-Aktivität von LRRC8 wurde nach Apoptose-Induktion in HeLa-Zellen überwacht, die LRRC8A mCerulean3 und LRRC8E mVenus exprimieren.
Tumornekrosefaktor alpha und Cycloheximid verursachten eine robuste SE-FRET-Abnahme, die sich in einem hypertonen Medium erholte. Die DMSO-Behandlung reduzierte die SE-FRET nicht, was die Spezifität für LRRC8 VRAC bestätigt.
