Nuestra investigación se centra en las propiedades y la función del transporte de membranas, específicamente en los transportadores de iones y canales como los canales de aniones y osmolitos formados por LRRC8. Investigamos sus mecanismos biofísicos, procesos reguladores y funciones fisiológicas celulares. Al final, también pretendemos dilucidar cómo su disfunción puede conducir a trastornos en los seres humanos.
Muchos laboratorios han avanzado en nuestra comprensión de los canales LRRC, resolviendo estructuras de complejos LRRC8, dilucidando propiedades electrofisiológicas y descubriendo diversas funciones fisiológicas. Sin embargo, queda una pregunta crucial: ¿cómo se regulan bioquímica y fisiológicamente estos canales y cómo influye la composición de subunidades en su activación y funciones dentro de la célula? Este método permite observar la actividad del canal LRRC8 en compartimentos típicamente inaccesibles para la electrofisiología, como los compartimentos intracelulares, sin perturbar la composición citosólica como lo haría la pinza de parche de célula completa.
Sus resoluciones subcelulares permiten la monitorización de los canales LRRC8 activados diferencialmente dentro de una sola célula y permiten una monitorización continua durante los procesos fisiológicos. Con este sensor basado en FRET, investigaremos la regulación y función de los canales VRAC LRRC8 en diferentes condiciones fisiológicas. Las preguntas clave son: cómo las subunidades reorganizan su confirmación; qué procesos de transducción de señales están involucrados con diferentes estímulos, y si existen diferencias entre los diferentes parálogos de LRRC8; y si existen diferencias subcelulares en los procesos fisiológicos.
Para empezar, prepara los tampones isotónicos, hipotónicos e hipertónicos. Con un osmómetro, mida la osmolaridad del tampón. El día antes de la transfección, siembra una por diez a la potencia de cinco células HeLa en dos mililitros de medio de cultivo celular en un plato de 35 milímetros.
Cultive las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, gota a gota, agregue la solución de transfección en un movimiento en espiral al plato. Mueva el plato cinco veces horizontal y verticalmente sobre la superficie del banco para mezclar la solución.
Cultive las células durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, verifique si hay transfección bajo un microscopio fluorescente. Tome las células que expresan las construcciones donante y aceptora y aspire el medio de cultivo celular.
Lavar las células tres veces con dos mililitros de tampón isotónico. Después de aspirar el tampón isotónico, agregue tres mililitros de tampón isotónico a las células y coloque la placa de muestra en la platina del microscopio. Cargue la microscopía con los ajustes de FRET o configure los canales necesarios para un experimento FRET: excitación del donante-emisión del donante, DD;donante-aceptador, DA; y aceptante-aceptante, AA. Encuentre un campo de visión con al menos una célula que exprese las construcciones donante y aceptora y ajuste la configuración del canal si es necesario.
Retire la placa de la platina del microscopio y colóquela de nuevo en la incubadora hasta que finalice el experimento. Tomar las células que expresan solo la construcción del donante y aspirar el medio de cultivo. Lavar las células tres veces con dos mililitros de tampón isotónico.
Después del último lavado, agregue tres mililitros de tampón isotónico a las células y coloque la placa de muestra en la platina del microscopio. Encuentre un campo de visión con al menos una célula que exprese la construcción donante. Imagen de todos los canales donante-donante, aceptante-aceptante y donante-aceptante.
Dibuje una región de interés o ROI alrededor de las células y mida la intensidad media de los canales donante-aceptor y donante-donante. Para la sustracción de fondo, dibuje un ROI en los canales donante-aceptor y donante-donante donde solo se encuentra la señal de fondo y mida la intensidad media. Después de obtener imágenes de las células, trace un ROI alrededor de las células y mida la intensidad media del canal donante-aceptor y aceptor-aceptor.
Para la sustracción de fondo, extraiga un ROI en los canales donante-aceptor y aceptor-aceptor donde solo se encuentra la señal de fondo y mida las intensidades medias. Por último, calcule los factores de corrección, beta y gamma, utilizando los valores determinados para el IDA corregido en segundo plano, el IDD en segundo plano y el IAA en segundo plano. Para empezar, aspire el tampón de las células HeLa previamente preparadas expresando el donante y el aceptor.
Lave las células con tres mililitros de tampón isotónico y coloque la placa de muestra en la platina del microscopio. Para la aspiración del tampón isotónico, fije y ajuste una cánula de manguera para que su punta llegue al fondo del plato. Para agregar tampones, fije y ajuste el tubo para permitir que el flujo de tampón impulsado por la gravedad caiga en el plato.
Encuentre un campo de visión con al menos una célula que exprese la construcción del donante y el aceptor simultáneamente y adquiera una imagen. Para la sustracción de fondo de la señal FRET, dibuje un ROI en el canal donante-aceptor donde solo se encuentra la señal de fondo y mida la intensidad media. Para la cuantificación de SE-FRET, trace un ROI alrededor de la célula y mida la intensidad media en los canales donante-donante, donante-aceptante y aceptor-aceptor para todas las imágenes de la serie temporal.
Configure un experimento de lapso de tiempo para los canales donante-donante, donante-aceptante y aceptor-aceptor con un intervalo de 10 segundos y una duración que cubra todas las condiciones de la secuencia de estimulación. Inicie la adquisición de las imágenes de lapso de tiempo y trace las trazas SE-FRET. Después de la medición de referencia, reemplace el tampón con flujo por gravedad.
En el experimento en vivo, aspire el tampón isotónico a través de la cánula de manguera, aplicando un vacío con una jeringa. Agregue tres mililitros del tampón de la siguiente condición por flujo de gravedad mientras continúa con las imágenes de lapso de tiempo. Para medir otra condición, lave la muestra en el siguiente tampón como se muestra anteriormente mientras continúa con las imágenes de lapso de tiempo.
Utilizando el método basado en FRET, se monitorizó la actividad del canal aniónico LRRC8 regulado por volumen durante la estimulación osmótica y la reducción de SE-FRET se correlacionó con la hipotonicidad extracelular. En otros experimentos, también se detectó la activación de LRRC8 VRAC por estímulos isismóticos como la señalización de diacilglicerol o la activación de miocitos. La actividad de LRRC8 VRAC se monitorizó tras la inducción de la apoptosis en células HeLa que expresan LRRC8A mCerulean3 y LRRC8E mVenus.
El factor de necrosis tumoral alfa y la cicloheximida causaron una fuerte disminución de SE-FRET, que se recuperó en un medio hipertónico. El tratamiento con DMSO no redujo el SE-FRET, lo que confirma la especificidad para LRRC8 VRAC.
