המחקר שלנו מתמקד בתכונות ובתפקוד של הובלת ממברנה, במיוחד מובילי יונים ותעלות כגון תעלות אניון ואוסמוליטים שנוצרו על ידי LRRC8. אנו חוקרים את המנגנונים הביופיזיקליים שלהם, תהליכי הבקרה והתפקודים הפיזיולוגיים של התא. בסופו של דבר, אנו שואפים גם להבהיר כיצד תפקוד לקוי שלהם עלול להוביל להפרעות בבני אדם.
מעבדות רבות קידמו את הבנתנו את תעלות LRRC, פענחו מבנים של קומפלקסים של LRRC8, הבהירו תכונות אלקטרופיזיולוגיות וחשפו תפקידים פיזיולוגיים מגוונים. עם זאת, נותרה שאלה מכרעת: כיצד מווסתים תעלות אלה מבחינה ביוכימית ופיזיולוגית וכיצד הרכב תת-היחידות משפיע על הפעלתן ותפקידיהן בתוך התא? שיטה זו מאפשרת לצפות בפעילות ערוץ LRRC8 בתאים שבדרך כלל אינם נגישים לאלקטרופיזיולוגיה, כגון תאים תוך-תאיים, מבלי להפריע להרכב הציטוסולי כמו מהדק טלאי של תא שלם.
הרזולוציות התת-תאיות שלו מאפשרות ניטור של תעלות LRRC8 המופעלות באופן דיפרנציאלי בתוך תא בודד ומאפשרות ניטור רציף במהלך תהליכים פיזיולוגיים. באמצעות חיישן מבוסס FRET זה, נחקור את הוויסות והתפקוד של תעלות LRRC8 VRAC בתנאים פיזיולוגיים שונים. שאלות המפתח הן: כיצד יחידות המשנה מסדרות מחדש את אישורן; אילו תהליכי העברת אותות מעורבים בגירויים שונים, והאם יש הבדלים בין הפרלוגים השונים של LRRC8; והאם יש הבדלים תת-תאיים בתהליכים הפיזיולוגיים.
כדי להתחיל, להכין את איזוטוני, hypotonic, ו hypertonic buffers. באמצעות אוסמומטר, למדוד את האוסמולריות של החיץ. יום לפני הטרנספקציה, זרעו אחד פי עשר בחזקת חמישה תאי HeLa בשני מיליליטר של מדיום תרבית תאים על צלחת של 35 מילימטר.
תרבית את התאים במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, טיפה, להוסיף פתרון transfection בתנועה ספירלית למנה. הזיזו את המנה חמש פעמים אופקית ואנכית על פני הספסל כדי לערבב את התמיסה.
תרבית את התאים במשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. למחרת, לבדוק transfection תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. קחו את התאים המבטאים הן את מבנה התורם והן את מבנה המקבל ושאפו למדיום תרבית התא.
לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של חיץ איזוטוני. לאחר שאיפת חיץ איזוטוני, מוסיפים שלושה מיליליטר של חיץ איזוטוני לתאים ומניחים את צלחת הדגימה על שלב המיקרוסקופ. טען הגדרות FRET במיקרוסקופ או הגדר את הערוצים הדרושים לניסוי FET:עירור תורם-פליטת תורם, DD;תורם-מקבל, DA; ומקבל-מקבל, א.א. מצא שדה ראייה עם תא אחד לפחות המבטא הן את מבנה התורם והן את מבנה המקבל והתאם את הגדרות הערוץ במידת הצורך.
מוציאים את הצלחת משלב המיקרוסקופ ומחזירים אותה לאינקובטור עד לניסוי. קחו את התאים המבטאים רק את מבנה התורם ושאפו למדיום התרבית. לשטוף את התאים שלוש פעמים עם שני מיליליטר של חיץ איזוטוני.
לאחר השטיפה האחרונה, מוסיפים שלושה מיליליטר של חיץ איזוטוני לתאים ומניחים את צלחת הדגימה על שלב המיקרוסקופ. מצא שדה ראייה עם לפחות תא אחד המבטא את מבנה התורם. דמיינו את כל ערוצי התורם-תורם, המקבל-מקבל והתורם-מקבל.
צייר אזור עניין או החזר השקעה סביב התאים ומדוד את העוצמה הממוצעת של ערוצי תורם-מקבל ותורם-תורם. לחיסור רקע, צייר החזר השקעה בערוצים תורם-מקבל ותורם-תורם שבהם נמצא רק אות הרקע ומדוד את העוצמה הממוצעת. לאחר הדמיה של התאים, ציירו החזר השקעה סביב התאים ומדדו את העוצמה הממוצעת של ערוץ התורם-מקבל והמקבל-מקבל.
לחיסור רקע, צייר החזר השקעה בערוצי התורם-מקבל והמקבל-מקבל שבהם נמצא רק אות הרקע ומדוד את העוצמות הממוצעות. לבסוף, חשב את גורמי התיקון, בטא וגמא, באמצעות הערכים שנקבעו עבור IDA מתוקן רקע, IDD מתוקן רקע ו- IAA מתוקן רקע. כדי להתחיל, שאפו את החיץ מתאי HeLa שהוכנו מראש המבטאים את התורם והמקבל.
לשטוף את התאים עם שלושה מיליליטר של חיץ איזוטוני ומניחים את צלחת הדגימה על שלב המיקרוסקופ. לשאיפת החיץ האיזוטוני, יש לתקן ולהתאים צינורית צינורית כך שקצהו יגיע לתחתית המנה. להוספת חוצצים, תקנו וכווננו את הצינור כדי לאפשר לזרימת החיץ המונעת על ידי כוח הכבידה לרדת לתוך הצלחת.
מצאו שדה ראייה שבו לפחות תא אחד המבטא את מבנה התורם והמקבל בו זמנית ורכשו תמונה. לחיסור רקע עבור אות FET, צייר החזר השקעה בערוץ התורם-מקבל שבו נמצא רק אות הרקע ומדוד את העוצמה הממוצעת. לכימות SE-FRET, ציירו החזר השקעה סביב התא ומדדו את העוצמה הממוצעת בערוצי התורם-תורם, התורם-מקבל והמקבל-מקבל עבור כל התמונות בסדרות הזמן.
הגדר ניסוי בהילוך מהיר עבור הערוצים תורם-תורם, תורם-מקבל ומקבל-מקבל עם מרווח של 10 שניות ומשך זמן כדי לכסות את כל התנאים של רצף הגירוי. התחל לרכוש את ההדמיה בהילוך מהיר והתווה את עקבות SE-FRET. לאחר מדידת קו הבסיס, החלף את המאגר בזרימת כוח הכבידה.
בניסוי החי, שאפו את החיץ האיזוטוני דרך צינורית הצינור, תוך הפעלת ואקום עם מזרק. הוסף שלושה מיליליטר של החיץ של המצב הבא על ידי זרימת הכבידה תוך המשך הדמיה בהילוך מהיר. כדי למדוד מצב אחר, שטוף את הדגימה במאגר הבא כפי שהוצג קודם לכן תוך המשך ההדמיה בהילוך מהיר.
באמצעות השיטה המבוססת על FRET, הפעילות של תעלת האניון LRRC8 המווסתת בנפח נוטרה במהלך גירוי אוסמוטי והפחתת SE-FRET הייתה בקורלציה עם היפוטוניות חוץ-תאית. בניסויים אחרים זוהתה גם הפעלת LRRC8 VRAC על ידי גירויים איזוסמוטיים כגון איתות דיאצילגליצרול או הפעלת מיוציטים. פעילות LRRC8 VRAC נוטרה עם השראת אפופטוזיס בתאי HeLa המבטאים LRRC8A mCerulean3 ו-LRRC8E mVenus.
גורם נמק הגידול אלפא וציקלוהקסימיד גרמו לירידה חזקה ב- SE-FRET, שהתאוששה בתווך היפרטוני. טיפול DMSO לא הפחית את SE-FRET, ואישר ספציפיות עבור LRRC8 VRAC.
