Araştırmamız, membran taşınımının özelliklerine ve işlevine, özellikle iyon taşıyıcılarına ve LRRC8 ile oluşturulmuş anyon ve ozmolit kanalları gibi kanallara odaklanmaktadır. Biyofiziksel mekanizmalarını, düzenleyici süreçlerini ve hücre fizyolojik fonksiyonlarını araştırıyoruz. Sonuç olarak, işlev bozukluklarının insanlarda nasıl bozukluklara yol açabileceğini de açıklamayı amaçlıyoruz.
Birçok laboratuvar, LRRC8 komplekslerinin yapılarını çözerek, elektrofizyolojik özellikleri açıklayarak ve çeşitli fizyolojik rolleri ortaya çıkararak LRRC kanalları hakkındaki anlayışımızı geliştirmiştir. Bununla birlikte, çok önemli bir soru devam etmektedir: bu kanallar biyokimyasal ve fizyolojik olarak nasıl düzenlenir ve alt birim bileşimi, hücre içindeki aktivasyonlarını ve rollerini nasıl etkiler? Bu yöntem, LRRC8 kanal aktivitesinin, hücre içi bölmeler gibi elektrofizyoloji için tipik olarak erişilemeyen bölmelerde, tüm hücre yama kelepçesinin yapacağı gibi sitozolik bileşimi bozmadan gözlemlenmesine izin verir.
Hücre altı çözünürlükleri, tek bir hücre içinde diferansiyel olarak aktive edilmiş LRRC8 kanallarının izlenmesini sağlar ve fizyolojik süreçler sırasında sürekli izlemeye izin verir. Bu FRET tabanlı sensörle, farklı fizyolojik koşullar altında LRRC8 VRAC kanallarının düzenlenmesini ve işlevini araştıracağız. Anahtar sorular şunlardır: alt birimlerin onaylarını nasıl yeniden düzenlediği; hangi sinyal iletim süreçlerinin farklı uyaranlarla ilgili olduğu ve LRRC8'in farklı paralogları arasında farklılıklar olup olmadığı; ve fizyolojik süreçlerde hücre altı farklılıklar olup olmadığı.
Başlamak için izotonik, hipotonik ve hipertonik tamponları hazırlayın. Bir ozmometre kullanarak, tamponun ozmolaritesini ölçün. Transfeksiyondan bir gün önce, 35 milimetrelik bir tabakta iki mililitre hücre kültürü ortamında beş HeLa hücresinin gücüne bir kez on tohum atın.
Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin. Ertesi gün, damla damla tabağa spiral hareketlerle transfeksiyon solüsyonu ekleyin. Çözeltiyi karıştırmak için tabağı tezgahın yüzeyinde yatay ve dikey olarak beş kez hareket ettirin.
Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin. Ertesi gün, floresan mikroskobu altında transfeksiyon olup olmadığını kontrol edin. Hem verici hem de alıcı yapıları ifade eden hücreleri alın ve hücre kültürü ortamını aspire edin.
Hücreleri iki mililitre izotonik tampon ile üç kez yıkayın. İzotonik tamponu aspire ettikten sonra, hücrelere üç mililitre izotonik tampon ekleyin ve numune kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Mikroskopi FRET ayarlarını yükleyin veya bir FRET deneyi için gerekli kanalları ayarlayın: donör uyarma-donör emisyonu, DD; donör-alıcı, DA; ve alıcı-alıcı, AA. Hem verici hem de alıcı yapıları ifade eden en az bir hücreye sahip bir görüş alanı bulun ve gerekirse kanal ayarlarını yapın.
Plakayı mikroskop aşamasından çıkarın ve deney yapılana kadar inkübatöre geri koyun. Sadece donör yapısını ifade eden hücreleri alın ve kültür ortamını aspire edin. Hücreleri iki mililitre izotonik tampon ile üç kez yıkayın.
Son yıkamadan sonra, hücrelere üç mililitre izotonik tampon ekleyin ve numune kabını mikroskop aşamasına yerleştirin. Verici yapısını ifade eden en az bir hücrenin bulunduğu bir görüş alanı bulun. Tüm verici-verici, alıcı-alıcı ve verici-alıcı kanallarını görüntüleyin.
Hücrelerin etrafına bir ilgi alanı veya ROI çizin ve verici-alıcı ve verici-donör kanallarının ortalama yoğunluğunu ölçün. Arka plan çıkarma işlemi için, yalnızca arka plan sinyalinin bulunduğu verici-alıcı ve verici-verici kanallarında bir ROI çizin ve ortalama yoğunluğu ölçün. Hücreleri görüntüledikten sonra, hücrelerin etrafına bir ROI çizin ve verici-alıcı ve alıcı-alıcı kanalının ortalama yoğunluğunu ölçün.
Arka plan çıkarma için, yalnızca arka plan sinyalinin bulunduğu verici-alıcı ve alıcı-alıcı kanallarında bir ROI çizin ve ortalama yoğunlukları ölçün. Son olarak, arka plan düzeltmeli IDA, arka plan düzeltmeli IDD ve arka plan düzeltmeli IAA için belirlenen değerleri kullanarak düzeltme faktörlerini, beta ve gama'yı hesaplayın. Başlamak için, donör ve alıcıyı ifade eden önceden hazırlanmış HeLa hücrelerinden tamponu aspire edin.
Hücreleri üç mililitre izotonik tamponla yıkayın ve numune kabını mikroskop tablasına yerleştirin. İzotonik tamponun aspirasyonu için, bir hortum kanülünü, ucu tabağın dibine ulaşacak şekilde sabitleyin ve ayarlayın. Tampon eklemek için, yerçekimi tahrikli tampon akışının tabağa düşmesine izin vermek için boruyu sabitleyin ve ayarlayın.
Verici ve alıcı yapısını aynı anda ifade eden en az bir hücrenin bulunduğu bir görüş alanı bulun ve bir görüntü elde edin. FRET sinyali için arka plan çıkarma için, yalnızca arka plan sinyalinin bulunduğu verici-alıcı kanalında bir ROI çizin ve ortalama yoğunluğu ölçün. SE-FRET nicelemesi için, hücrenin etrafına bir ROI çizin ve zaman serisindeki tüm görüntüler için verici-verici, verici-alıcı ve alıcı-alıcı kanallarındaki ortalama yoğunluğu ölçün.
Verici-verici, verici-alıcı ve alıcı-alıcı kanalları için 10 saniyelik bir aralıkla ve stimülasyon dizisinin tüm koşullarını kapsayacak bir süre ile hızlandırılmış bir deney ayarlayın. Zaman atlamalı görüntülemeyi almaya başlayın ve SE-FRET izlerini çizin. Temel ölçümden sonra, tamponu yerçekimi akışıyla değiştirin.
Canlı deneyde, izotonik tamponu hortum kanülü aracılığıyla aspire edin ve bir şırınga ile vakum uygulayın. Hızlandırılmış görüntülemeye devam ederken yerçekimi akışıyla bir sonraki koşulun tamponundan üç mililitre ekleyin. Başka bir koşulu ölçmek için, hızlandırılmış görüntülemeye devam ederken numuneyi daha önce gösterildiği gibi bir sonraki tamponda yıkayın.
FRET tabanlı yöntem kullanılarak, hacim regüle LRRC8 anyon kanalının aktivitesi, ozmotik stimülasyon ve hücre dışı hipotonisite ile ilişkili SE-FRET redüksiyonu sırasında izlendi. Diğer deneylerde, diasilgliserol sinyali veya miyosit aktivasyonu gibi izozmotik uyaranlarla LRRC8 VRAC aktivasyonu da tespit edildi. LRRC8A mCerulean3 ve LRRC8E mVenüs'ü eksprese eden HeLa hücrelerinde apoptoz indüksiyonu üzerine LRRC8 VRAC aktivitesi izlendi.
Tümör nekroz faktörü alfa ve sikloheksimid, hipertonik bir ortamda iyileşen sağlam bir SE-FRET düşüşüne neden oldu. DMSO tedavisi SE-FRET'i azaltmadı ve LRRC8 VRAC için özgüllüğü doğruladı.
