La nostra ricerca si concentra sulle proprietà e la funzione del trasporto di membrana, in particolare sui trasportatori ionici e sui canali come l'anione formato da LRRC8 e i canali osmolitici. Studiamo i loro meccanismi biofisici, i processi regolatori e le funzioni fisiologiche cellulari. Alla fine, miriamo anche a chiarire come la loro disfunzione possa portare a disturbi negli esseri umani.
Molti laboratori hanno migliorato la nostra comprensione dei canali LRRC, risolvendo le strutture dei complessi LRRC8, chiarendo le proprietà elettrofisiologiche e scoprendo diversi ruoli fisiologici. Tuttavia, rimane una domanda cruciale: in che modo questi canali sono regolati biochimicamente e fisiologicamente e in che modo la composizione delle subunità influenza la loro attivazione e i loro ruoli all'interno della cellula? Questo metodo consente di osservare l'attività del canale LRRC8 in compartimenti tipicamente inaccessibili per l'elettrofisiologia, come i compartimenti intracellulari, senza disturbare la composizione citosolica come farebbe il patch-clamp a cellula intera.
Le sue risoluzioni subcellulari consentono il monitoraggio dei canali LRRC8 attivati in modo differenziale all'interno di una singola cellula e consentono il monitoraggio continuo durante i processi fisiologici. Con questo sensore basato su FRET, studieremo la regolazione e la funzione dei canali VRAC LRRC8 in diverse condizioni fisiologiche. Le domande chiave sono: come le subunità riorganizzano la loro conferma; quali processi di trasduzione del segnale sono coinvolti con diversi stimoli e se ci sono differenze tra i diversi paraloghi di LRRC8; e se ci sono differenze subcellulari nei processi fisiologici.
Per iniziare, prepara i tamponi isotonici, ipotonici e ipertonici. Utilizzando un osmometro, misurare l'osmolarità del tampone. Il giorno prima della trasfezione, seminare una volta per dieci alla potenza di cinque cellule HeLa in due millilitri di terreno di coltura cellulare su un piatto da 35 millimetri.
Coltiva le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il giorno seguente, goccia a goccia, aggiungere la soluzione di trasfezione con movimenti a spirale al piatto. Muovi il piatto cinque volte orizzontalmente e verticalmente sulla superficie del banco per mescolare la soluzione.
Coltiva le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, controllare la trasfezione al microscopio a fluorescenza. Prelevare le cellule che esprimono sia il costrutto donatore che quello accettore e aspirare il terreno di coltura cellulare.
Lavare le cellule tre volte con due millilitri di tampone isotonico. Dopo aver aspirato il tampone isotonico, aggiungere tre millilitri di tampone isotonico alle cellule e posizionare il piatto del campione sul tavolino del microscopio. Caricare le impostazioni FRET della microscopia o impostare i canali necessari per un esperimento FRET: eccitazione del donatore-emissione del donatore, DD; donatore-accettore, DA; e accettore-accettore, AA. Trova un campo visivo con almeno una cellula che esprime sia il costrutto donatore che quello accettore e regola le impostazioni del canale se necessario.
Rimuovere la piastra dal tavolino del microscopio e riposizionarla nell'incubatrice fino al termine dell'esperimento. Prelevare le cellule che esprimono solo il costrutto donatore e aspirare il terreno di coltura. Lavare le cellule tre volte con due millilitri di tampone isotonico.
Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere tre millilitri di tampone isotonico alle cellule e posizionare il piatto del campione sul tavolino del microscopio. Trova un campo visivo con almeno una cellula che esprime il costrutto del donatore. Immagina tutti i canali donatore-donatore, accettore-accettore e donatore-accettore.
Disegna una regione di interesse o ROI intorno alle cellule e misura l'intensità media dei canali donatore-accettore e donatore-donatore. Per la sottrazione di fondo, tracciare un ROI nei canali donatore-accettore e donatore-donatore dove si trova solo il segnale di fondo e misurare l'intensità media. Dopo aver eseguito l'imaging delle cellule, tracciare una ROI attorno alle cellule e misurare l'intensità media del canale donatore-accettore e accettore-accettore.
Per la sottrazione di fondo, tracciare un ROI nei canali donatore-accettore e accettatore-accettore in cui si trova solo il segnale di fondo e misurare le intensità medie. Infine, calcolare i fattori di correzione, beta e gamma, utilizzando i valori determinati per l'IDA corretto per lo sfondo, l'IDD corretto per lo sfondo e l'IAA corretto per lo sfondo. Per iniziare, aspirare il tampone dalle cellule HeLa precedentemente preparate che esprimono il donatore e l'accettore.
Lavare le cellule con tre millilitri di tampone isotonico e posizionare il piatto del campione sul tavolino del microscopio. Per l'aspirazione del tampone isotonico, fissare e regolare una cannula del tubo flessibile in modo che la sua punta raggiunga il fondo del piatto. Per l'aggiunta di tamponi, fissare e regolare il tubo in modo che il flusso tampone guidato dalla gravità cada nella parabola.
Trova un campo visivo con almeno una cellula che esprime contemporaneamente il costrutto donatore e accettore e acquisisci un'immagine. Per la sottrazione di fondo per il segnale FRET, tracciare una ROI nel canale donatore-accettore dove si trova solo il segnale di fondo e misurare l'intensità media. Per la quantificazione SE-FRET, tracciare un ROI intorno alla cellula e misurare l'intensità media nei canali donatore-donatore, donatore-accettore e accettore-accettore per tutte le immagini della serie temporale.
Impostare un esperimento time-lapse per i canali donatore-donatore, donatore-accettore e accettore-accettore con un intervallo di 10 secondi e una durata che copra tutte le condizioni della sequenza di stimolazione. Avviare l'acquisizione dell'imaging time-lapse e tracciare le tracce SE-FRET. Dopo la misurazione di base, sostituire il tampone con il flusso per gravità.
Nell'esperimento dal vivo, aspirare il tampone isotonico attraverso la cannula del tubo, applicando un vuoto con una siringa. Aggiungere tre millilitri del tampone della condizione successiva mediante flusso di gravità mentre si continua l'imaging time-lapse. Per misurare un'altra condizione, lavare il campione nel tampone successivo come mostrato in precedenza mentre si continua l'imaging time-lapse.
Utilizzando il metodo basato su FRET, l'attività del canale anionico LRRC8 regolato dal volume è stata monitorata durante la stimolazione osmotica e la riduzione SE-FRET è stata correlata con l'ipotonia extracellulare. In altri esperimenti, è stata rilevata anche l'attivazione di LRRC8 VRAC da parte di stimoli isosmotici come la segnalazione del diacilglicerolo o l'attivazione dei miociti. L'attività di LRRC8 VRAC è stata monitorata dopo l'induzione dell'apoptosi in cellule HeLa che esprimono LRRC8A mCerulean3 e LRRC8E mVenus.
Il fattore di necrosi tumorale alfa e la cicloesimide hanno causato una robusta diminuzione di SE-FRET, che si è ripresa in un mezzo ipertonico. Il trattamento con DMSO non ha ridotto il SE-FRET, confermando la specificità di LRRC8 VRAC.
