Nossa pesquisa se concentra nas propriedades e funções do transporte de membrana, especificamente transportadores de íons e canais como canais de ânion e osmólito formados por LRRC8. Investigamos seus mecanismos biofísicos, processos regulatórios e funções fisiológicas celulares. No final, também pretendemos elucidar como sua disfunção pode levar a distúrbios em humanos.
Muitos laboratórios avançaram nossa compreensão dos canais LRRC, resolvendo estruturas de complexos LRRC8, elucidando propriedades eletrofisiológicas e descobrindo diversos papéis fisiológicos. No entanto, uma questão crucial permanece: como esses canais são regulados bioquímica e fisiologicamente e como a composição da subunidade influencia sua ativação e papéis dentro da célula? Este método permite observar a atividade do canal LRRC8 em compartimentos tipicamente inacessíveis para eletrofisiologia, como compartimentos intracelulares, sem perturbar a composição citosólica como o patch-clamp de células inteiras.
Suas resoluções subcelulares permitem o monitoramento de canais LRRC8 ativados diferencialmente dentro de uma única célula e permitem o monitoramento contínuo durante os processos fisiológicos. Com este sensor baseado em FRET, investigaremos a regulação e a função dos canais LRRC8 VRAC sob diferentes condições fisiológicas. As principais questões são: como as subunidades reorganizam sua confirmação; quais processos de transdução de sinal estão envolvidos com diferentes estímulos e se existem diferenças entre os diferentes parálogos de LRRC8; e se existem diferenças subcelulares nos processos fisiológicos.
Para começar, prepare os tampões isotônicos, hipotônicos e hipertônicos. Usando um osmômetro, meça a osmolaridade do tampão. No dia anterior à transfecção, semeie uma vez dez elevado a cinco células HeLa em dois mililitros de meio de cultura celular em um prato de 35 milímetros.
Cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, gota a gota, adicione a solução de transfecção em um movimento espiral ao prato. Mova o prato cinco vezes horizontal e verticalmente na superfície da bancada para misturar a solução.
Cultive as células durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, verifique se há transfecção em um microscópio fluorescente. Pegue as células que expressam as construções doadoras e aceitadoras e aspire o meio de cultura celular.
Lave as células três vezes com dois mililitros de tampão isotônico. Após aspirar o tampão isotônico, adicione três mililitros de tampão isotônico às células e coloque o prato de amostra no microscópio stage. Carregar as configurações de FRET de microscopia ou configurar os canais necessários para um experimento FRET: excitação do doador-emissão do doador, DD;doador-aceitador, DA; e aceitador-aceitador, AA. Encontre um campo de visão com pelo menos uma célula expressando as construções doador e aceitador e ajuste as configurações do canal, se necessário.
Remova a placa do microscópio stage e coloque-a de volta na incubadora até o experimento. Pegue as células que expressam apenas a construção do doador e aspire o meio de cultura. Lave as células três vezes com dois mililitros de tampão isotônico.
Após a última lavagem, adicione três mililitros de tampão isotônico às células e coloque o prato de amostra no microscópio stage. Encontre um campo de visão com pelo menos uma célula expressando a construção do doador. Crie imagens de todos os canais doador-doador, aceitador-aceitador e doador-aceitador.
Desenhe uma região de interesse ou ROI ao redor das células e meça a intensidade média dos canais doador-aceitador e doador-doador. Para subtração de fundo, desenhe um ROI nos canais doador-aceitador e doador-doador onde apenas o sinal de fundo é encontrado e meça a intensidade média. Depois de obter imagens das células, desenhe um ROI ao redor das células e meça a intensidade média do canal doador-aceitador e aceitador-aceitador.
Para subtração de fundo, desenhe um ROI nos canais doador-aceitador e aceitador-aceitador onde apenas o sinal de fundo é encontrado e meça as intensidades médias. Por fim, calcule os fatores de correção, beta e gama, usando os valores determinados para ADF corrigido de fundo, IDD corrigido de fundo e IAA corrigido de fundo. Para começar, aspire o tampão das células HeLa previamente preparadas que expressam o doador e o aceitador.
Lave as células com três mililitros de tampão isotônico e coloque o prato de amostra no microscópio stage. Para aspiração do tampão isotônico, fixe e ajuste uma cânula de mangueira de forma que sua ponta alcance o fundo do prato. Para adicionar amortecedores, fixe e ajuste a tubulação para permitir que o fluxo de amortecedor acionado pela gravidade caia no prato.
Encontre um campo de visão com pelo menos uma célula expressando a construção doadora e aceitadora simultaneamente e adquira uma imagem. Para subtração de fundo para o sinal FRET, desenhe um ROI no canal doador-aceitador onde apenas o sinal de fundo é encontrado e meça a intensidade média. Para quantificação SE-FRET, desenhe um ROI ao redor da célula e meça a intensidade média nos canais doador-doador, doador-aceitador e aceitador-aceitador para todas as imagens da série temporal.
Configure um experimento de lapso de tempo para os canais doador-doador, doador-aceitador e aceitador-aceitador com um intervalo de 10 segundos e uma duração para cobrir todas as condições da sequência de estimulação. Inicie a aquisição da imagem de lapso de tempo e trace os traços SE-FRET. Após a medição da linha de base, substitua o buffer pelo fluxo por gravidade.
No experimento ao vivo, aspire o tampão isotônico através da cânula da mangueira, aplicando um vácuo com uma seringa. Adicione três mililitros do buffer da próxima condição por fluxo de gravidade enquanto continua a imagem de lapso de tempo. Para medir outra condição, lave a amostra no próximo tampão, conforme mostrado anteriormente, enquanto continua a imagem de lapso de tempo.
Usando o método baseado em FRET, a atividade do canal de ânion LRRC8 regulado por volume foi monitorada durante a estimulação osmótica e a redução de SE-FRET correlacionada com a hipotonicidade extracelular. Em outros experimentos, a ativação do VRAC LRRC8 por estímulos isosmóticos, como sinalização de diacilglicerol ou ativação de miócitos, também foi detectada. A atividade de LRRC8 VRAC foi monitorada após a indução de apoptose em células HeLa expressando LRRC8A mCerulean3 e LRRC8E mVenus.
O fator de necrose tumoral alfa e a cicloheximida causaram uma diminuição robusta do SE-FRET, que se recuperou em meio hipertônico. O tratamento com DMSO não reduziu o SE-FRET, confirmando a especificidade para LRRC8 VRAC.
