私たちの研究は、膜輸送、特にLRRC8形成陰イオンチャネルや浸透圧チャネルなどのイオントランスポーターとチャネルの性質と機能に焦点を当てています。その生物物理学的メカニズム、制御過程、細胞生理機能について調べています。最終的には、その機能不全がヒトの疾患にどのようにつながるのかを解明することも目指しています。
多くの研究室でLRRCチャネルの理解が進み、LRRC8複合体の構造が解明され、電気生理学的特性が解明され、多様な生理学的役割が明らかになっています。しかし、これらのチャネルは生化学的および生理学的にどのように制御され、サブユニット組成は細胞内でのそれらの活性化と役割にどのように影響するのでしょうか?この方法により、全細胞パッチクランプのように細胞質組成を乱すことなく、通常は細胞内コンパートメントなどの電気生理学ではアクセスできないコンパートメントでのLRRC8チャネル活性を観察できます。
その細胞内分解能により、単一細胞内の差次的に活性化されたLRRC8チャネルのモニタリングが可能になり、生理学的プロセス中の継続的なモニタリングが可能になります。このFRETベースのセンサーを使用して、さまざまな生理学的条件下でのLRRC8 VRACチャネルの制御と機能を調査します。主な質問は、サブユニットがどのように確認を再配置するかです。どのシグナル伝達プロセスが異なる刺激に関与しているか、およびLRRC8の異なるパラログ間に違いがあるかどうか。そして、生理学的プロセスに細胞内の違いがあるかどうか。
まず、アイソトニック、ハイポトニック、およびハイトニックバッファーを準備します。浸透圧計を使用して、バッファーの浸透圧を測定します。トランスフェクションの前日に、35mm皿に載せた2ミリリットルの細胞培養液に1×10のHeLa細胞を5乗で播種します。
細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩培養します。翌日、滴下して、トランスフェクション溶液をらせん状に皿に加えます。ベンチの表面で皿を水平と垂直に5回動かして、溶液を混合します。
細胞を摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩培養します。翌日、蛍光顕微鏡でトランスフェクションを確認します。ドナーコンストラクトとアクセプターコンストラクトの両方を発現する細胞を採取し、細胞培養培地を吸引します。
細胞を2ミリリットルの等張緩衝液で3回洗浄します。アイソトニックバッファーを吸引した後、細胞に3ミリリットルのアイソトニックバッファーを加え、サンプルディッシュを顕微鏡ステージに置きます。顕微鏡検査のFRET設定をロードするか、FRET実験に必要なチャンネルを設定します:ドナー励起-ドナー放出、DD;ドナー-アクセプター、DA;およびアクセプター-アクセプター、AA。ドナーとアクセプターの両方のコンストラクトを発現する細胞が少なくとも 1 つある視野を見つけ、必要に応じてチャネル設定を調整します。
プレートを顕微鏡ステージから取り外し、実験が始まるまでインキュベーターに戻します。ドナーコンストラクトのみを発現する細胞を採取し、培地を吸引します。細胞を2ミリリットルの等張緩衝液で3回洗浄します。
最後の洗浄後、細胞に3ミリリットルの等張緩衝液を追加し、サンプル皿を顕微鏡ステージに置きます。ドナーコンストラクトを発現する細胞が少なくとも1つある視野を見つけます。すべてのドナー-ドナー、アクセプター-アクセプター、およびドナー-アクセプターチャネルをイメージします。
細胞の周囲に関心領域またはROIを描画し、ドナー-アクセプターチャネルおよびドナー-ドナーチャネルの平均強度を測定します。バックグラウンド減算の場合、バックグラウンド信号のみが検出されるドナー-アクセプターチャネルとドナー-ドナーチャネルでROIを描画し、平均強度を測定します。細胞をイメージングした後、細胞の周囲にROIを描画し、ドナー-アクセプターおよびアクセプター-アクセプターチャネルの平均強度を測定します。
バックグラウンド減算の場合、バックグラウンド信号のみが検出されるドナー-アクセプターチャネルとアクセプター-アクセプターチャネルでROIを描画し、平均強度を測定します。最後に、バックグラウンド補正された IDA、バックグラウンド補正された IDD、およびバックグラウンド補正された IAA について決定された値を使用して、補正係数 (ベータとガンマ) を計算します。まず、ドナーとアクセプターを発現する事前に調製したHeLa細胞からバッファーを吸引します。
細胞を3ミリリットルの等張緩衝液で洗浄し、サンプル皿を顕微鏡ステージに置きます。等張バッファーの吸引には、ホースカニューレを固定して調整し、その先端が皿の底に達するようにします。バッファーを追加するには、重力駆動のバッファーの流れが皿に落ちるようにチューブを固定して調整します。
ドナーとアクセプターコンストラクトを同時に発現する少なくとも1つの細胞を含む視野を見つけ、画像を取得します。FRET信号のバックグラウンド減算については、バックグラウンド信号のみが見つかったドナー-アクセプターチャネルでROIを描画し、平均強度を測定します。SE-FRETの定量化では、細胞の周囲にROIを描画し、時系列のすべての画像について、ドナー-ドナーチャネル、ドナー-アクセプターチャネル、およびアクセプター-アクセプターチャネルの平均強度を測定します。
ドナー-ドナー-ドナー、ドナー-アクセプター、アクセプター-アクセプターの各チャネルのタイムラプス実験を、刺激シーケンスのすべての条件をカバーするために、10秒の間隔と持続時間で設定します。タイムラプスイメージングの取得を開始し、SE-FRETトレースをプロットします。ベースライン測定後、バッファーを重力流に交換します。
ライブ実験では、ホースカニューレを介して等張緩衝液を吸引し、シリンジで真空を適用します。タイムラプス撮影を続けながら、重力流により次の条件のバッファーを3ミリリットル加えます。別の状態を測定するには、タイムラプスイメージングを続けながら、前に示したように次のバッファーでサンプルを洗浄します。
FRETベースの方法を使用して、浸透圧刺激中に体積調節されたLRRC8陰イオンチャネルの活性をモニターし、SE-FRETの減少は細胞外低張性と相関しました。他の実験では、ジアシルグリセロールシグナル伝達や筋細胞の活性化などの等化刺激によるLRRC8 VRACの活性化も検出されました。LRRC8A mCerulean3およびLRRC8E mVenusを発現するHeLa細胞におけるアポトーシス誘導により、LRRC8 VRAC活性をモニターしました。
腫瘍壊死因子αとシクロヘキシミドは、SE-FRETの強力な減少を引き起こし、これは高張培地で回復しました。DMSO処理はSE-FRETを減少させず、LRRC8 VRACの特異性を確認しました。
