Целью нашего исследования является разработка нового метода in vitro для быстрой и чувствительной оценки токсичности и экотоксичности загрязнителей, основанного на оценке подвижности гемоцитов Mytilus galloprovincialis в качестве модельного организма. Методы, основанные на воздействии, такие как биоанализы in vitro и in vivo, представляют собой инновационные инструменты для обнаружения воздействия химических загрязнителей окружающей среды на живые организмы. Эти методы могут служить инструментами в экологическом биомониторинге и оценке рисков.
Это исследование устраняет значительный пробел в токсикологии, уделяя особое внимание использованию подвижности гемоцитов в качестве новой конечной точки для оценки воздействия загрязняющих веществ на мидии. Хотя подвижность гемоцитов имеет решающее значение для иммунных реакций, их чувствительность к воздействию загрязняющих веществ у двустворчатых моллюсков недостаточно изучена. Наши результаты продвигают исследования в области токсикологии и экотоксикологии по нескольким направлениям.
Предлагая новую конечную точку для скрининга токсичности, поддерживая этические исследования путем минимизации тестирования позвоночных и повышая применимость в экотоксикологии. Этот подход может иметь широкое применение в биомониторинге окружающей среды и может быть адаптирован для других иммунных клеток в экотоксикологии. Для начала предварительно наполните шприц 0,5 миллилитрами стандартного физиологического раствора, темперированного до 15 градусов Цельсия.
Поместите акклиматизированный экземпляр взрослой мидии для сбора гемолимфы. С помощью скальпеля слегка и аккуратно раздвиньте створки по брюшной поверхности. Удерживайте скальпель в нужном положении или используйте наконечник пипетки, чтобы держать пространство открытым.
Затем введите иглу шприца для подкожных инъекций в пространство между клапанами. Аккуратно соберите 0,5 миллилитра гемолимфы из задней приводящей мышцы с помощью предварительно заполненного шприца. Теперь извлеките иглу из шприца и перенесите содержимое шприца в микротрубку.
Соберите образцы, собранные из трех-четырех мидий, в пробирке, поддерживая температуру 15 градусов по Цельсию. Оценив жизнеспособность гемоцитов, для их культивирования добавьте 50 микролитров разведенной гемолимфы в лунки 96-луночного плоскодонного, полистирольного, обработанного ТС микропланшета, и накройте пластину своей крышкой. Дайте гемоцитам прилипнуть к дну лунок в течение 30 минут при температуре 15 градусов Цельсия для образования монослоя.
Затем с помощью микропипетки аккуратно отсасывайте излишки гемолимфы из лунок. Для проведения кратковременных анализов в течение одного-четырех часов следует немедленно добавить 100 микролитров интересующего вещества, растворенного в физиологическом растворе. При длительной экспозиции от 24 до 48 часов инкубируют культивируемые адгезивные клетки с исследуемым веществом, растворенным в добавляемой питательной среде при температуре 15 градусов Цельсия.
Для начала получите культивированные гемоциты, обработанные интересующим веществом. Для усиленной визуализации гемоцитов удалите инкубационную среду из каждой лунки и окрашивайте клетки 100 микролитрами нейтрального красного раствора окрашивающего красителя перед интервальной микроскопией. Инкубируйте клетки при температуре 15 градусов Цельсия в климатической камере в течение 15 минут.
После инкубации смойте излишки красителя, и добавьте 100 микролитров интересующего вещества, растворенного в стандартном физиологическом растворе. Вставьте многолуночный планшет с обработанными клетками в многорежимный считыватель. Выполняйте визуализацию на пластине в режиме реального времени с помощью интервальной микроскопии с 20-кратным увеличением и визуализацией в светлом поле.
Для отслеживания ячеек и вычисления скоростных параметров получите отдельные кадры с помощью программного обеспечения Gen5 и сохраните изображения в папке без пробелов в имени. В ImageJ перейдите в раздел «Файл», а затем «Импорт» и «Последовательность изображений». Выполняйте отслеживание отдельных ячеек с помощью плагина ручного отслеживания.
Импортируйте наборы данных из плагина ручного отслеживания ImageJ в программное обеспечение Chemotaxis and Migration Tool. Выберите нужное количество срезов для отслеживания. Откалибруйте программное обеспечение с помощью настроек размера пикселя X/Y и временного интервала.
После установки параметров нажмите на кнопку «Применить настройки». Построение траекторий и экспорт в виде изображения. Нажмите на кнопку «Измеренные значения», чтобы просмотреть результаты, и сохраните данные.
Затем нажмите на кнопку «Статистика» и сохраните данные о скорости и прямоте для серии треков. Сравните рассчитанные скоростные параметры контрольных клеток с таковыми у гемоцитов, подвергшихся воздействию исследуемого вещества в различных концентрациях. Подвижность гемоцитов оценивали с помощью покадровой визуализации, показывающей движения отдельных клеток в течение 10 минут, с последовательным отслеживанием пронумерованных клеток в трех временных точках нулевого, 5 и 10 минут.
Наблюдались два морфотипа гемоцитов: раскидистые клетки и более мелкие круглые звездообразные клетки. Оба типа демонстрировали непрерывные изменения формы из-за активности ламеллиподий и псевдоподий. Графики скорости и прямоты показали, что в базальных физиологических условиях спредные клетки двигались быстрее по сравнению с меньшими клетками.
Воздействие парацетамола значительно снижало подвижность распространяющихся клеток через 24 часа, в то время как мелкие клетки не показали такого снижения. Прямота мелких клеток значительно увеличилась после 24 часов воздействия парацетамола, в то время как спред клетки показали снижение прямоты уже через час.
