Lo scopo della nostra ricerca è quello di sviluppare un nuovo metodo in vitro per la valutazione rapida e sensibile della tossicità e dell'ecotossicità degli inquinanti basata sulla valutazione della motilità degli emociti di Mytilus galloprovincialis come organismo modello. I metodi basati sugli effetti, come i biosaggi in vitro e in vivo, rappresentano strumenti innovativi per rilevare gli effetti degli inquinanti chimici ambientali sugli organismi viventi. Questi metodi possono servire come strumenti per il biomonitoraggio ambientale e la valutazione del rischio.
Questa ricerca affronta una lacuna significativa in tossicologia concentrandosi sull'utilizzo della motilità degli emociti come nuovo endpoint per valutare l'effetto degli inquinanti sulle cozze. Sebbene la motilità degli emociti sia fondamentale per le risposte immunitarie, la sua sensibilità all'esposizione agli inquinanti è poco studiata nei bivalvi. Le nostre scoperte fanno avanzare la ricerca in tossicologia ed ecotossicologia in diversi modi.
Offrendo un nuovo endpoint per lo screening della tossicità, sostenendo la ricerca etica riducendo al minimo i test sui vertebrati e promuovendo l'applicabilità in ecotossicologia. Questo approccio può avere un'ampia applicazione nel biomonitoraggio ambientale e potrebbe essere adattato ad altre cellule immunitarie in ecotossicologia. Per iniziare, pre-riempire una siringa con 0,5 millilitri di soluzione fisiologica standard temperata a 15 gradi Celsius.
Posizionare l'esemplare di cozze adulte acclimatato per la raccolta dell'emolinfa. Usando un bisturi, fare leva leggermente e con attenzione sulle valvole lungo la superficie ventrale. Mantenere il bisturi in posizione o utilizzare una punta per pipetta per mantenere lo spazio aperto.
Quindi, inserire l'ago di una siringa ipodermica nello spazio tra le valvole. Raccogliere delicatamente 0,5 millilitri di emolinfa dal muscolo adduttore posteriore utilizzando la siringa preriempita. Ora, rimuovi l'ago dalla siringa e trasferisci il contenuto della siringa in un microtubo.
Raggruppare i campioni raccolti da tre o quattro cozze insieme in un tubo mantenendo la temperatura di 15 gradi Celsius. Dopo aver valutato la vitalità degli emociti, per coltivarli, aggiungere 50 microlitri di emolinfa diluita nei pozzetti di una micropiastra a 96 pozzetti, a fondo piatto, in polistirene, trattata con TC e coprire la piastra con il coperchio. Lasciare che gli emociti aderiscano al fondo dei pozzetti per 30 minuti a 15 gradi Celsius per formare un monostrato.
Quindi, utilizzando una micropipetta, aspirare delicatamente l'emolinfa in eccesso dai pozzetti. Per eseguire saggi a breve termine entro una o quattro ore, aggiungere immediatamente 100 microlitri della sostanza di interesse disciolta in soluzione fisiologica. Per esposizioni prolungate da 24 a 48 ore, incubare le cellule aderenti in coltura con la sostanza in esame disciolta nel terreno di coltura integrato a 15 gradi Celsius.
Per iniziare, procurati gli emociti in coltura trattati con la sostanza di interesse. Per una migliore visualizzazione degli emociti, rimuovere il terreno di incubazione da ciascun pozzetto e colorare le cellule con 100 microlitri di soluzione colorante vitale rosso neutro prima della microscopia time-lapse. Incubare le cellule a 15 gradi Celsius in camera climatica per 15 minuti.
Dopo l'incubazione, lavare via il colorante in eccesso e aggiungere 100 microlitri della sostanza di interesse disciolta in soluzione fisiologica standard. Inserire la piastra multipozzetto contenente le cellule trattate in un lettore multimodale. Esegui l'imaging in tempo reale sulla lastra attraverso la microscopia time-lapse con ingrandimento 20X e la visualizzazione in campo chiaro.
Per il tracciamento delle celle e il calcolo dei parametri velocimetrici, ottenere i singoli fotogrammi utilizzando il software Gen5 e salvare le immagini in una cartella senza spazi nel nome. In ImageJ, passare a File, quindi a Importa e Sequenza immagini. Esegui il tracciamento delle celle su singole celle utilizzando il plug-in di tracciamento manuale.
Importa i set di dati dal plug-in di tracciamento manuale ImageJ nel software Chemotaxis and Migration Tool. Selezionare il numero desiderato di sezioni per il tracciamento. Calibrare il software con le impostazioni della dimensione dei pixel X/Y e dell'intervallo di tempo.
Dopo aver impostato i parametri, fare clic su Applica impostazioni. Traccia le traiettorie ed esporta come immagine. Fare clic sul pulsante Valori misurati per visualizzare i risultati e salvare i dati.
Quindi, fai clic sul pulsante Statistiche e salva i dati di velocità e immediatezza per la serie di tracce. Confrontare i parametri velocimetrici calcolati delle cellule di controllo con quelli degli emociti esposti alla sostanza in esame a concentrazioni variabili. La motilità degli emociti è stata valutata utilizzando l'imaging time-lapse, che mostra i movimenti delle singole cellule nell'arco di 10 minuti, con un monitoraggio coerente delle cellule numerate in tre punti temporali di zero, cinque e 10 minuti.
Sono stati osservati due morfotipi di emociti, cellule che si diffondono e cellule più piccole rotonde a forma di stella. Entrambi i tipi hanno mostrato continui cambiamenti di forma dovuti all'attività dei lamellipodi e degli pseudopodi. I grafici di velocità e immediatezza hanno indicato che, in condizioni fisiologiche basali, le cellule diffuse si muovevano più velocemente rispetto alle cellule più piccole.
L'esposizione al paracetamolo ha ridotto significativamente la motilità delle cellule diffuse dopo 24 ore, mentre le piccole cellule non hanno mostrato tale riduzione. L'immediatezza delle piccole cellule è aumentata significativamente dopo 24 ore di esposizione al paracetamolo, mentre le cellule diffuse hanno mostrato una diminuzione dell'immediatezza dopo appena un'ora.
