El objetivo de nuestra investigación es desarrollar un nuevo método in vitro para la evaluación rápida y sensible de la toxicidad y ecotoxicidad de contaminantes basado en la evaluación de la motilidad de los hemocitos de Mytilus galloprovincialis como organismo modelo. Los métodos basados en los efectos, como los bioensayos in vitro e in vivo, representan herramientas innovadoras para detectar los efectos de los contaminantes químicos ambientales en los organismos vivos. Estos métodos pueden servir como herramientas en el biomonitoreo ambiental y la evaluación de riesgos.
Esta investigación aborda un vacío significativo en toxicología al centrarse en el uso de la motilidad de los hemocitos como nuevo criterio de valoración para evaluar el efecto de los contaminantes en los mejillones. Aunque la motilidad de los hemocitos es crucial para las respuestas inmunitarias, su sensibilidad a la exposición a contaminantes está poco estudiada en los bivalvos. Nuestros hallazgos hacen avanzar la investigación en toxicología y ecotoxicología de varias maneras.
Ofreciendo un nuevo criterio de valoración para el cribado de toxicidad, apoyando la investigación ética minimizando las pruebas con vertebrados y avanzando en la aplicabilidad en ecotoxicología. Este enfoque puede tener una amplia aplicación en la biomonitorización ambiental y podría adaptarse a otras células inmunitarias en ecotoxicología. Para comenzar, llene previamente una jeringa con 0,5 mililitros de solución salina fisiológica estándar templada a 15 grados centígrados.
Coloque el espécimen de mejillón adulto aclimatado para la colección de hemolinfa. Con un bisturí, separe ligera y cuidadosamente las válvulas a lo largo de la superficie ventral. Mantenga el bisturí en su posición o utilice una punta de pipeta para mantener el espacio abierto.
Luego, inserte la aguja de una jeringa hipodérmica en el espacio entre las válvulas. Recoja suavemente 0,5 mililitros de hemolinfa del músculo aductor posterior con la jeringa precargada. Ahora, retire la aguja de la jeringa y transfiera el contenido de la jeringa a un microtubo.
Agrupar las muestras recolectadas de tres a cuatro mejillones juntos en un tubo manteniendo la temperatura de 15 grados centígrados. Después de evaluar la viabilidad de los hemocitos, para cultivarlos, agregue 50 microlitros de hemolinfa diluida en los pocillos de una microplaca de poliestireno tratada con TC de 96 pocillos, de fondo plano, y cubra la placa con su tapa. Deje que los hemocitos se adhieran al fondo de los pocillos durante 30 minutos a 15 grados centígrados para formar una monocapa.
A continuación, con una micropipeta, aspire suavemente el exceso de hemolinfa de los pocillos. Para realizar ensayos a corto plazo en un plazo de una a cuatro horas, agregue inmediatamente 100 microlitros de la sustancia de interés disuelta en solución salina fisiológica. Para exposiciones prolongadas de 24 a 48 horas, incubar las células adherentes cultivadas con la sustancia problema disuelta en el medio de cultivo suplementado a 15 grados centígrados.
Para empezar, obtenga los hemocitos cultivados tratados con la sustancia de interés. Para mejorar la visualización de los hemocitos, retire el medio de incubación de cada pocillo y tiña las células con 100 microlitros de solución de tinción de colorante vital rojo neutro antes de la microscopía de lapso de tiempo. Incubar las células a 15 grados centígrados en una cámara climática durante 15 minutos.
Después de la incubación, lavar el exceso de colorante y agregar 100 microlitros de la sustancia de interés disuelta en solución salina fisiológica estándar. Inserte la placa de pocillos múltiples que contiene las células tratadas en un lector multimodo. Realice imágenes en tiempo real de la placa a través de microscopía de lapso de tiempo con un aumento de 20X y visualización de campo claro.
Para el seguimiento de celdas y el cálculo de los parámetros velocimétricos, obtenga los fotogramas individuales con el software Gen5 y guarde las imágenes en una carpeta sin espacios en el nombre. En ImageJ, vaya a Archivo, seguido de Importar y Secuencia de imágenes. Realice el seguimiento de celdas en celdas individuales utilizando el complemento de seguimiento manual.
Importe conjuntos de datos desde el complemento de seguimiento manual ImageJ al software Chemotaxis and Migration Tool. Seleccione el número deseado de segmentos para el seguimiento. Calibre el software con los ajustes de tamaño de píxel X/Y e intervalo de tiempo.
Después de configurar los parámetros, haga clic en Aplicar configuración. Traza trayectorias y expórtalas como una imagen. Haga clic en el botón Valores medidos para ver los resultados y guardar los datos.
A continuación, haga clic en el botón Estadísticas y guarde los datos de velocidad y dirección de la serie de pistas. Comparar los parámetros velocimétricos calculados de las células de control con los de los hemocitos expuestos a la sustancia problema a concentraciones variables. La motilidad de los hemocitos se evaluó mediante imágenes de lapso de tiempo, que mostraron los movimientos de las células individuales durante 10 minutos, con un seguimiento consistente de las células numeradas en tres puntos de tiempo de cero, cinco y 10 minutos.
Se observaron dos morfotipos de hemocitos, células dispersas y células redondas más pequeñas en forma de estrella. Ambos tipos mostraron cambios continuos de forma debido a la actividad de los lamelipodios y seudópodos. Los gráficos de velocidad y dirección indicaron que, en condiciones fisiológicas basales, las células dispersas se movieron más rápido en comparación con las células más pequeñas.
La exposición al paracetamol redujo significativamente la motilidad de las células diseminadas después de 24 horas, mientras que las células pequeñas no mostraron tal reducción. La franqueza de las células pequeñas aumentó significativamente después de 24 horas de exposición al paracetamol, mientras que las células esparcidas mostraron una disminución de la franqueza después de solo una hora.
