본 연구의 범위는 모델 유기체인 Mytilus galloprovincialis의 혈구 운동성 평가를 기반으로 오염 물질의 독성 및 생태독성을 신속하고 민감하게 평가하기 위한 새로운 in vitro 방법을 개발하는 것입니다. in vitro 및 in vivo bio assay와 같은 효과 기반 방법은 환경 화학 오염 물질이 살아있는 유기체에 미치는 영향을 감지하기 위한 혁신적인 도구입니다. 이러한 방법은 환경 생물 모니터링 및 위험 평가의 도구로 사용할 수 있습니다.
이 연구는 홍합에 대한 오염 물질의 영향을 평가하기 위한 새로운 종점으로 혈구 운동성을 사용하는 데 중점을 두어 독성학의 중요한 격차를 해결합니다. 혈구 운동성은 면역 반응에 매우 중요하지만, 이매패류에서는 오염 물질 노출에 대한 민감도에 대한 연구가 부족합니다. 우리의 발견은 여러 가지 방법으로 독성학 및 생태 독성학에 대한 연구를 발전시킵니다.
독성 스크리닝을 위한 새로운 종점을 제공하고, 척추동물 검사를 최소화하여 윤리적 연구를 지원하고, 생태독성학의 적용 가능성을 발전시킴으로써. 이 접근 방식은 환경 생물 모니터링에 광범위하게 적용될 수 있으며 생태 독성학의 다른 면역 세포에 적용할 수 있습니다. 먼저 섭씨 15도로 템퍼링된 0.5ml의 표준 생리식염수를 주사기에 미리 채웁니다.
혈림프 수집을 위해 순응된 성인 홍합 표본을 배치합니다. 메스를 사용하여 복부 표면을 따라 판막을 약간 조심스럽게 들어 올립니다. 메스를 제자리에 유지하거나 피펫 팁을 사용하여 공간을 열어 두십시오.
그런 다음 피하 주사기의 바늘을 밸브 사이의 공간에 삽입합니다. 미리 채워진 주사기를 사용하여 후방 내전근에서 0.5ml의 혈림프를 부드럽게 수집합니다. 이제 주사기에서 바늘을 제거하고 주사기의 내용물을 마이크로튜브로 옮깁니다.
3-4 개의 홍합에서 수집 한 샘플을 섭씨 15도의 온도를 유지하는 튜브에 함께 모입니다. 혈구 생존력을 평가한 후 배양하기 위해 50마이크로리터의 희석된 혈림프를 96웰의 평평한 바닥, 폴리스티렌, TC 처리된 마이크로플레이트의 웰에 넣고 플레이트를 뚜껑으로 덮습니다. hemocytes가 섭씨 15도에서 30분 동안 우물 바닥에 부착되어 단층을 형성하도록 합니다.
그런 다음 마이크로 피펫을 사용하여 우물에서 과도한 혈림프를 부드럽게 흡인합니다. 1-4시간 이내에 단기 분석을 수행하려면 생리식염수에 용해된 관심 물질 100마이크로리터를 즉시 첨가하십시오. 24-48시간의 장기간 노출의 경우, 보충된 배양 배지에 용해된 테스트 물질과 함께 배양된 부착 세포를 섭씨 15도에서 배양합니다.
우선, 관심 물질로 처리된 배양된 혈구를 얻습니다. 혈구의 시각화를 향상시키려면 각 웰에서 배양 배지를 제거하고 타임 랩스 현미경 검사 전에 100마이크로리터의 중성 적색 바이탈 염료 염색 용액으로 세포를 염색합니다. 섭씨 15도의 기후실에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
배양 후 여분의 염료를 씻어내고 표준 생리식염수에 용해된 관심 물질 100마이크로리터를 첨가합니다. 처리된 세포가 포함된 다중 웰 플레이트를 다중 모드 리더에 삽입합니다. 20X 배율의 타임 랩스 현미경 검사와 명시야 시각화를 통해 플레이트에서 실시간 이미징을 수행합니다.
셀 추적 및 속도 측정 매개변수를 계산하려면 Gen5 소프트웨어를 사용하여 개별 프레임을 얻고 이름에 공백이 없는 폴더에 이미지를 저장합니다. ImageJ에서 File(파일)로 이동한 다음 Import(가져오기) 및 Image Sequence(이미지 시퀀스)로 이동합니다. Manual Tracking 플러그인을 사용하여 단일 세포에서 세포 추적을 수행합니다.
ImageJ 수동 추적 플러그인에서 Chemotaxis 및 Migration Tool 소프트웨어로 데이터 세트를 가져옵니다. 추적할 슬라이스 수를 선택합니다. X/Y 픽셀 크기 및 시간 간격 설정으로 소프트웨어를 보정합니다.
매개변수를 설정한 후 설정 적용을 클릭합니다. 궤적을 플롯하고 이미지로 내보냅니다. 측정값 버튼을 클릭하여 결과를 보고 데이터를 저장합니다.
그런 다음 통계 버튼을 클릭하고 트랙 시리즈에 대한 속도 및 직진성 데이터를 저장합니다. 대조 세포의 계산된 속도 측정 매개변수를 다양한 농도로 테스트 물질에 노출된 혈구의 매개변수와 비교합니다. 적혈구 운동성은 타임 랩스 이미징을 사용하여 평가되었으며, 0분, 5분, 10분의 세 가지 시점에 걸쳐 번호가 매겨진 세포를 일관되게 추적하여 10분 이상의 개별 세포 움직임을 보여주었습니다.
혈구의 두 가지 형태형, 즉 퍼져 있는 세포와 더 작은 둥근 별 모양의 세포가 관찰되었습니다. 두 유형 모두 얇은 층상과 가성족부 활동으로 인해 지속적인 형태 변화를 보였습니다. 속도 및 직접성 플롯은 기초 생리학적 조건에서 확산 세포가 작은 세포에 비해 더 빠르게 움직인다는 것을 나타냅니다.
파라세타몰 노출은 24시간 후 확산 세포의 운동성을 유의하게 감소시켰지만, 소형 세포는 이러한 감소를 보이지 않았습니다. 스몰 세포의 직접성은 파라세타몰 노출 24시간 후 현저히 증가한 반면, 퍼진 세포는 단 1시간 후에 직접성이 감소하는 것으로 나타났습니다.
