私たちの研究の範囲は、モデル生物としてのMytilus galloprovincialisの血球運動性の評価に基づいて、汚染物質の毒性と生態毒性を迅速かつ高感度に評価するための新しいin vitro法を開発することです。in vitroおよびin vivoバイオアッセイなどの効果ベースの方法は、環境化学汚染物質が生物に及ぼす影響を検出するための革新的なツールです。これらの方法は、環境バイオモニタリングとリスク評価のツールとして役立ちます。
この研究は、ムール貝に対する汚染物質の影響を評価するための新しいエンドポイントとして血球運動性を使用することに焦点を当てることにより、毒物学の大きなギャップに対処します。血球の運動性は免疫応答にとって重要ですが、二枚貝では汚染物質への曝露に対するその感受性は十分に研究されていません。私たちの発見は、毒物学と生態毒性学の研究をいくつかの方法で進めます。
毒性スクリーニングの新たなエンドポイントを提供し、脊椎動物の検査を最小限に抑えることで倫理的研究を支援し、生態毒性学への適用性を向上させることです。このアプローチは、環境バイオモニタリングに広く応用でき、生態毒性学の他の免疫細胞にも適用できます。まず、シリンジに15°Cにテンパリングされた0.5ミリリットルの標準的な生理食塩水を事前に充填します。
順応した成体のムール貝標本を血リンパ採取のために配置します。メスを使用して、腹面に沿ってバルブをわずかに慎重に離します。メスを所定の位置に保持するか、ピペットチップを使用してスペースを開いたままにします。
次に、皮下注射器の針を弁の間のスペースに挿入します。プレフィルドシリンジを使用して、後内転筋から0.5ミリリットルの血リンパを静かに収集します。次に、シリンジから針を取り外し、シリンジの内容物をマイクロチューブに移します。
3〜4個のムール貝から採取したサンプルを、摂氏15度に保たれたチューブにプールします。血球の生存率を評価した後、それらを培養するには、希釈した血リンパ液を50マイクロリットルの96ウェル、平底、ポリスチレン、TC処理マイクロプレートのウェルに加え、プレートを蓋で覆います。血球を15°Cで30分間ウェルの底に付着させて、単層を形成します。
次に、マイクロピペットを使用して、ウェルから余分な血リンパを穏やかに吸引します。1〜4時間以内に短期間のアッセイを行うには、生理食塩水に溶解した目的の物質を直ちに100マイクロリットル追加します。24時間から48時間の長時間曝露の場合は、添加した培地に溶解した試験物質を15°Cで培養した接着細胞とインキュベートしてください。
まず、目的の物質で処理した培養血球を入手します。血球の可視化を強化するには、各ウェルからインキュベーション培地を取り出し、タイムラプス顕微鏡検査の前に100マイクロリットルの中性赤色バイタル色素染色溶液で細胞を染色します。細胞を摂氏15度で気候室で15分間インキュベートします。
インキュベーション後、余分な色素を洗い流し、標準的な生理食塩水に溶解した目的の物質100マイクロリットルを加えます。処理した細胞を含むマルチウェルプレートをマルチモードリーダーに挿入します。20倍の倍率でタイムラプス顕微鏡を使用し、明視野で可視化することで、プレート上でリアルタイムイメージングを行います。
細胞の追跡と速度パラメータの計算には、Gen5ソフトウェアを使用して個々のフレームを取得し、名前にスペースを入れないフォルダに画像を保存します。ImageJ で、[ファイル] に移動し、[インポート] と [イメージ シーケンス] に移動します。手動トラッキングプラグインを使用して、単一セルのセルトラッキングを実行します。
ImageJ手動追跡プラグインからChemotaxisおよび移行ツールソフトウェアにデータセットをインポートします。トラッキングするスライスの数を選択します。X/Y ピクセル サイズと時間間隔の設定でソフトウェアをキャリブレーションします。
パラメータを設定したら、[設定の適用]をクリックします。軌跡をプロットし、画像としてエクスポートします。[測定値]ボタンをクリックして結果を表示し、データを保存します。
次に、[統計]ボタンをクリックして、トラックシリーズの速度と直接性のデータを保存します。コントロール細胞の計算された速度測定パラメータを、さまざまな濃度で試験物質に曝露された血球のパラメータと比較します。血球の運動性は、タイムラプスイメージングを使用して評価され、10 分間にわたる個々の細胞の動きが示され、0、5、および 10 分の 3 つの時点で番号が付けられた細胞を一貫して追跡しました。
血液細胞の2つの形態型、すなわち拡散細胞と小さな丸い星型細胞が観察された。どちらのタイプも、ラメリポディアとシュードポディアの活動により連続的な形状変化を示しました。速度プロットと直接性プロットは、基礎生理学的条件下では、拡散細胞が小さな細胞と比較してより速く移動することを示しました。
パラセタモール曝露は、24時間後に広がった細胞の運動性を有意に低下させましたが、小細胞はそのような減少を示さなかった。小細胞の直接性は、パラセタモール曝露の24時間後に有意に増加したが、広がった細胞はわずか1時間後に直接性の低下を示した。
