היקף המחקר שלנו הוא לפתח שיטה חדשה במבחנה להערכה מהירה ורגישה של הרעילות והרעילות האקולוגית של מזהמים בהתבסס על הערכת תנועתיות ההמוציטים של Mytilus galloprovincialis כאורגניזם מודל. שיטות מבוססות אפקט, כגון מבחני ביו in vitro ו-in vivo, מייצגות כלים חדשניים לזיהוי ההשפעות של מזהמים כימיים סביבתיים על אורגניזמים חיים. שיטות אלו יכולות לשמש ככלים בניטור ביולוגי סביבתי והערכת סיכונים.
מחקר זה מתייחס לפער משמעותי בטוקסיקולוגיה על ידי התמקדות בשימוש בתנועתיות המוציטים כנקודת קצה חדשה להערכת השפעת המזהמים על מולים. למרות שתנועתיות ההמוציטים חיונית לתגובות חיסוניות, רגישותו לחשיפה למזהמים אינה נחקרת מספיק ב-bivalves. הממצאים שלנו מקדמים את המחקר בטוקסיקולוגיה ואקוטוקסיקולוגיה בכמה דרכים.
על ידי הצעת נקודת קצה חדשה לסינון רעילות, תמיכה במחקר אתי על ידי מזעור בדיקות בעלי חוליות וקידום ישימות באקוטוקסיקולוגיה. לגישה זו יכול להיות יישום נרחב בניטור ביולוגי סביבתי וניתן להתאים אותה לתאים חיסוניים אחרים באקוטוקסיקולוגיה. כדי להתחיל, מלאו מראש מזרק ב-0.5 מיליליטר של מי מלח פיזיולוגיים סטנדרטיים ממוזגים ל-15 מעלות צלזיוס.
מקם את דגימת המולים הבוגרת המתאקלמת לאוסף המולימפה. בעזרת אזמל מפרקים מעט ובזהירות את השסתומים לאורך פני הגחון. שמור על האזמל במקומו או השתמש בקצה פיפטה כדי לשמור על החלל פתוח.
לאחר מכן, הכנס את המחט של מזרק היפודרמי לחלל שבין השסתומים. אוספים בעדינות 0.5 מיליליטר המולימפה משריר המקרב האחורי באמצעות המזרק הממולא מראש. כעת, הסר את המחט מהמזרק והעביר את תכולת המזרק למיקרו-צינור.
אחסנו את הדגימות שנאספו משלושה עד ארבעה מולים יחד בצינור תוך שמירה על טמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס. לאחר הערכת כדאיות ההמוציטים, כדי לתרבת אותם, הוסף 50 מיקרוליטר של המולימפה מדולל לבארות של 96 בארות, תחתית שטוחה, פוליסטירן, שטופלה ב- TC, וכסה את הצלחת במכסה שלה. הניחו להמוציטים להיצמד לתחתית הבארות למשך 30 דקות בחום של 15 מעלות צלזיוס ליצירת שכבה חד-שכבתית.
לאחר מכן, בעזרת מיקרופיפטה, שאפו בעדינות עודפי המולימפה מהבארות. כדי לבצע בדיקות לטווח קצר תוך שעה עד ארבע שעות, הוסף מיד 100 מיקרוליטר מהחומר המעניין המומס במי מלח פיזיולוגיים. לחשיפות ממושכות של 24 עד 48 שעות, דגרו את התאים הדבקים בתרבית עם חומר הבדיקה המומס במדיום התרבית התוסף ב-15 מעלות צלזיוס.
כדי להתחיל, השג את ההמוציטים המתורבתים שטופלו בחומר המעניין. להדמיה משופרת של המוציטים, הסר את מדיום הדגירה מכל באר, וצבוע את התאים ב-100 מיקרוליטר של תמיסת צביעת צבע חיוני אדום ניטרלי לפני מיקרוסקופ זמן-lapse. דגרו על התאים בטמפרטורה של 15 מעלות צלזיוס בתא אקלים למשך 15 דקות.
לאחר הדגירה יש לשטוף את עודפי הצבע ולהוסיף 100 מיקרוליטר מהחומר המעניין המומס במי מלח פיזיולוגיים סטנדרטיים. הכנס את הצלחת מרובת הבארות המכילה את התאים המטופלים לקורא רב-מצבי. בצע הדמיה בזמן אמת על הלוח באמצעות מיקרוסקופ דולג זמן בהגדלה של פי 20 והדמיה של שדה בהיר.
למעקב אחר תאים וחישוב פרמטרים מהירים, השג את המסגרות הבודדות באמצעות תוכנת Gen5, ושמור את התמונות בתיקייה ללא רווחים בשם. ב-ImageJ, נווט אל קובץ, ולאחר מכן ייבוא ורצף תמונות. בצע מעקב אחר תאים בודדים באמצעות תוסף המעקב הידני.
ייבא מערכי נתונים מתוסף המעקב הידני ImageJ לתוכנת Chemotaxis ו-Migration Tool. בחר את מספר הפרוסות הרצוי למעקב. כייל את התוכנה עם הגדרות גודל הפיקסלים X/Y ומרווח הזמן.
לאחר הגדרת הפרמטרים, לחץ על החל הגדרות. התוויית מסלולים וייצוא כתמונה. לחץ על כפתור הערכים הנמדדים כדי להציג את התוצאות ולשמור את הנתונים.
לאחר מכן, לחץ על כפתור הסטטיסטיקה ושמור את נתוני המהירות והישירות עבור סדרת המסלולים. השווה את הפרמטרים הוולוצימטריים המחושבים של תאי בקרה לאלו של המוציטים שנחשפו לחומר הבדיקה בריכוזים משתנים. תנועתיות ההמוציטים הוערכה באמצעות הדמיית זמן-lapse, שהראתה תנועות תאים בודדים במשך 10 דקות, עם מעקב עקבי אחר תאים ממוספרים על פני שלוש נקודות זמן של אפס, חמש ו-10 דקות.
נצפו שני מורפוטיפים של המוציטים, תאים מתפשטים ותאים עגולים קטנים יותר בצורת כוכב. שני הסוגים הראו שינויי צורה מתמשכים עקב פעילות lamellipodia ופסאודופודיה. תרשימי מהירות וישירות הצביעו על כך שבתנאים פיזיולוגיים בסיסיים, תאים מפוזרים נעו מהר יותר בהשוואה לתאים קטנים יותר.
חשיפה לאקמול הפחיתה משמעותית את התנועתיות של תאים מפוזרים לאחר 24 שעות, בעוד שתאים קטנים לא הראו ירידה כזו. הישירות של תאים קטנים עלתה משמעותית לאחר 24 שעות של חשיפה לאקמול, בעוד שתאים מפוזרים הראו ירידה בישירות לאחר שעה אחת בלבד.
