Il<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studiare Contributi degli agenti patogeni e Host alla colite infettiva

Riepilogo

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.

Abstract

Questo protocollo descrive i passi necessari per produrre un modello robusto di malattie infettive e colite, così come i metodi utilizzati per caratterizzare Citrobacter rodentium infezione nei topi. C. rodentium è un batterio gram negativo, murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla clinicamente importante enteropatogeno E. umana patogeni coli e E. enteroemorragica coli. Dopo infezione con C. rodentium, topi immunocompetenti soffrono di perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Istologicamente, allungamento cripta intestinale, infiltrazione di cellule immunitarie, e la deplezione delle cellule calice si osservano. Liquidazione di infezione è raggiunto dopo 3 o 4 settimane. Misurazione della barriera epiteliale intestinale integrità, carica batterica, e danno istologico a tempi diversi dopo l'infezione, consentono la caratterizzazione dei ceppi di topi suscettibili all'infezione.

Il meccanismo di virulenzas con il quale batteri patogeni colonizzano il tratto intestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici che difendono contro le infezioni siano poco conosciuti. Pertanto l'C. rodentium modello di infezione batterica enterica è uno strumento prezioso per aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell'intestino). È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi visti in pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici. Pertanto, lo studio di modelli di colite infettiva offre un notevole potenziale per la definizione di risposta dell'ospite potenzialmente patogeni per i batteri enterici. C. rodentium colite indotta da uno di questi modelli è raro che permette l'analisi delle risposte di accoglienza per i batteri enterici, la nostra comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD;essenziale nello sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.

Introduzione

Infezione da batteri patogeni enterici innesca gastrointestinale (GI) infiammazione, nonché intestinale patologia e fisiopatologia, incluse diarrea e disfunzione barriera epiteliale intestinale. I meccanismi di virulenza di batteri patogeni che colonizzano il tratto gastrointestinale dei loro ospiti, così come le risposte di accoglienza specifici per difendersi contro tali infezioni sono poco conosciuti, ma recenti progressi nella modellazione di enterici infezioni batteriche hanno iniziato ad aiutare la nostra comprensione di questi processi. Batteri enterici sono stati collegati a malattie infiammatorie intestinali (malattie infiammatorie dell'intestino). La malattia di Crohn malattie infiammatorie dell'intestino (CD) e UC sono malattie complesse di eziologia sconosciuta, caratterizzata da infiammazione cronica intestinale e danni ai tessuti. Molti modelli murini di infiammazione intestinale esistono, da infiammazione spontanea in ceppi geneticamente modificati, come IL10 - / - topi, alle sfide con composti chimici, come destrano solfato sodico (DSS) e dinitrobenzene solfonico (DNBS) ^1. È stato ipotizzato che le risposte infiammatorie croniche disadattivi presenti nei pazienti IBD sviluppano in individui geneticamente predisposti dopo esposizione anormale del sistema immunitario della mucosa intestinale di batteri enterici ^2, quindi lo studio dei modelli di colite infettiva offre anche notevoli potenzialità per definire potenzialmente patogeni ospitante . risposte a batteri enterici Citrobacter rodentium colite indotta è uno dei pochi modelli di colite infettiva che è stata ben caratterizzata ^1,3, consentendo l'analisi delle risposte dell'ospite ai batteri enterici e ulteriore comprensione dei potenziali meccanismi di patogenesi IBD; un passo essenziale per lo sviluppo di nuovi trattamenti preventivi e terapeutici.

C. rodentium è un gram negativo fissaggio e effacing (A / E), murino specifico patogeno batterico che è strettamente legata alla umana importantepatogeni enteropatogeno E. coli (EPEC) e enteroemorragica E. coli (EHEC) ^3-8. La famiglia di una patogeni / E intimamente collegare alla membrana apicale della cellula ospite dell'epitelio cecale e colon, formando un non-invasiva piedistallo struttura simile sulla cellula ospite. Sfida orale con C. rodentium di 10 ⁸ -10 ⁹ organismi produce un robusto modello di colite infettiva caratterizzata da iperplasia del colon o allungamento delle cripte, infiltrazione di cellule mononucleate immunitario e deplezione delle cellule calice ^3,4. Il sito iniziale di colonizzazione, poche ore dopo la sfida, è la patch cieco, seguita dalla progressione verso il colon distale 2 o 3 giorni dopo l'infezione ^3. In ceppi di topi immunocompetenti, la clearance del patogeno viene raggiunto 3 a 4 settimane dopo l'infezione ^1,3,4. Tuttavia, molti ceppi geneticamente modificati, cioè gene carente o knockout (- / -) topi, sono stati trovati per visualizzare Increased suscettibilità alle infezioni con conseguenti danni esagerato e / o infezione e infiammazione cronica ^9-14. L'utilizzo di questo modello di colite infettiva in questi ceppi ad eliminazione diretta, molti mancano innate proteine ​​di segnalazione, è stato indispensabile nel rivelare proteine ​​ospite diverse integrali alla risoluzione di infezione intestinale e l'infiammazione.

Protocollo

1. Preparazione di Citrobacter rodentium inoculo e sonda gastrica di topi

1. Preparare e sterilizzare in autoclave Luria Bertani brodo (LB).
2. Ottenere vitale C. rodentium da uno stock di glicerolo congelata e striscia sulla piastra LB agar con un'ansa sterile da inoculo o punta della pipetta. Incubare a 37 ° C per una notte. Inoculare 3 ml di brodo LB sterile in una provetta di coltura falcon con colonie dalla piastra LB utilizzando una ansa o punta della pipetta. Preparazione dell'inoculo deve essere fatto utilizzando tecniche asettiche.
3. Incubare la C. cultura rodentium aerobiosi a 37 ° C per una notte in una incubazione banco agitatore a 200 rpm. Il brodo LB inoculato dovrebbe apparire torbida dopo la coltura durante la notte.
4. Usare una lampadina punta dell'ago gastrica gavage attaccato ad una siringa da 1 ml per gavage ciascun topo con 100 microlitri della overnight C. rodentium cultura. Delicatamente collottola il mouse, impugnando saldamente la pelle flaccida sul suo collo e schienacon il pollice e le dita. Tirare indietro la testa dell'animale con il dito indice per immobilizzare la testa e raddrizzare l'esofago per l'inserimento dell'ago gavage.
5. Mantenere il mouse in posizione verticale e dirigere la punta dell'ago bulbo gavage lungo il lato della sua bocca e sulla sua lingua. Delicatamente passare l'ago lungo il tetto della bocca e farlo avanzare l'esofago. In caso di resistenza che avverte durante questa procedura, rimuovere l'ago gavage e reinserirla.
6. Lentamente iniettare 100 ml di inoculo batterico e rimuovere delicatamente l'ago gavage. Monitorare la frequenza respiratoria e il comportamento del mouse dopo il ritorno alla sua gabbia.

Note:

• Nelle fasi 2 e 3, anche preparare una provetta di coltura falcon utilizzando tecniche asettiche con 3 ml di brodo LB sterile per essere coltivate durante la notte per assicurare che non vi è alcuna contaminazione batterica del brodo stesso. Il brodo LB dovrebbe apparire chiaro dopo coltura durante la notte.
• Agitare delicatamente la coltura nel tubo falcon prima di caricare siringhe per gavage modo che una dose uguale di batteri è consegnato a ciascun topo, nel passaggio 4.
• Durante la notte la cultura deve essere eliminata se è stato inoculato per oltre 24 ore.
• Tutti C. infezioni rodentium e abitazioni di animali infetti deve essere effettuata in un impianto di livello di biosicurezza 2.

2. Misurazione del colon permeabilità epiteliale Barriera in C. rodentium topi infettati

1. Misurare integrità della barriera in un punto temporale desiderato post-infezione.
2. Il giorno del saggio, preparare abbastanza 4 kDa isotiocianato di fluoresceina (FITC)-destrano dissolto in tampone fosfato (PBS) ad una concentrazione di 80 mg ml ^-1 per gavage ciascun topo con 150 microlitri e preparare la curva standard.
3. Scruff il mouse e sonda gastrica con 150 ml di FITC-destrano. Estrarre il cibo dalla gabbia in questo momento.
4. Anestetizzare topi 4 ore dopogavaging e raccogliere il sangue il più possibile (~ 450 microlitri) tramite puntura cardiaca. Aggiungere il sangue ad una concentrazione finale del 3% acido citrato destrosio in una provetta da microcentrifuga per scoraggiare coagulazione. Eutanasia i topi e raccogliere i tessuti del colon in PBS per la conta batterica (passi 3,1-3,5) e in formalina al 10% per la fissazione dei tessuti e, infine, colorazione di immunofluorescenza (passi 4,1-4,8).
5. Centrifugare i campioni di sangue a 1000 xg per 12 min in una centrifuga a 4 ° C. Raccogliere il siero e diluire a 1/10 e 1/100 in PBS. Aggiungere 100 pl di ciascun campione a questi due diluizioni ad una piastra a 96 pozzetti in replicati.
6. Per preparare la curva standard, diluire l'originale 80 mg ml ^-1 FITC-destrano usato per sonda gastrica i topi in PBS per le seguenti concentrazioni: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, e 0 mg / ml . Aggiungere 100 pl di ciascuna concentrazione di una piastra a 96 pozzetti in triplicato.
7. Quantificare la fluorescenza di ciascun campione utilizzando un fluorimetro a una eccitazione wavelength di 485 nm e 535 nm di lunghezza d'onda di emissione.
8. Analizzare i dati grezzi tracciando la curva standard. Inserire i dati grezzi per ciascun campione nell'equazione della linea generata dalla curva standard per determinare la concentrazione di FITC-destrano in ciascun campione.

Note:

• Dal punto 4 in poi, tenere i campioni di sangue in ghiaccio e ridurre al minimo l'esposizione alla luce.
• Quando si misura l'integrità della barriera epiteliale un punto di tempo, o prima, 7 giorni dopo l'infezione è ottimale, in quanto gravi danni ai tessuti avviene dopo questo punto. Misurazione integrità della barriera prima che si verificano gravi danni permette di determinare le differenze massime di permeabilità durante C. infezione rodentium tra ceppi di topi.
• Assicurarsi che topi di controllo non infettate sono anche testati per l'integrità della barriera epiteliale.

3. Misura della carica batterica in tessuti di C. rodentium topi infettati

1. Aggiungere 1 ml di PBS sterile unnd un metallo sterilizzato tallone ad un fondo tondo 2 tubi da centrifuga ml utilizzando una tecnica asettica. I singoli tessuti prelevati da ciascun animale sarà posto in tubi separati PBS. Pesare i tubi prima dell'aggiunta del tessuto.
2. Rimuovere il cieco e colon dal mouse. Separare il cieco dal colon e spingere il contenuto luminale con una pinzetta. Aggiungere il contenuto in un tubo di PBS. Dopo aver separato le sezioni 0,5 centimetri dal colon distale e cieco per il 10% fissazione in formalina, aprì il colon rimanente e cieco longitudinalmente e lavare con PBS sterile prima di mettere i tessuti in tubi.
3. Pesare i tubi PBS con il tessuto e poi omogeneizzare i campioni utilizzando un battitore tallone per 6 min a 30 Hz.
4. Utilizzando tecniche asettiche, aggiungere 180 microlitri di PBS sterile per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 microlitri di ciascun campione omogeneizzato al primo pozzetto in ciascuna riga. Mescolare bene e diluire serialmente, aggiungendo 20 microlitri di ogni precedente e di ottenere diluizioni da 10 ^-1 (prima sill) a 10 ^-6. Piastra 10 microlitri di ogni diluizione di ciascun campione in triplicato su una lastra quadrata LB inferiore con una griglia. Incubare per una notte a 37 ° C.
5. Contare le unità formanti colonie (CFU), quindi la media dei 3 punti, e registrare la diluizione alla quale è stato contato ogni campione. Moltiplicare media di 50 CFU, come 20 pl del campione originale 1 ml è stato usato, e per il fattore di diluizione alla quale è stato contato il campione risultante in CFU / ml. Infine, dividere per il peso del tessuto per determinare CFU / g.

4. La valutazione istologica e colorazione immunofluorescenza dei tessuti infetti Colon

1. Raccogliere tessuti come nel passo 3,2. Tessuti Conservare in formalina durante la notte, poi lavare con etanolo al 70%. Incorpora tessuti in paraffina e tagliati 5 sezioni micron per la colorazione. Colorazione con ematossilina & eosina per la valutazione istologica e procedere con i seguenti passi per la colorazione di immunofluorescenza.
2. Per Deparaffinare tessuti prima della colorazione, posto scorre inuna vaschetta di colorazione Coplin e mettere in 65 ° C bagnomaria per 10 min. Quindi, porre i vetrini in xilene per quattro lavaggi di 2 minuti ciascuna. Vetrini devono poi essere reidratato con due lavaggi di 5 minuti in etanolo al 100%, seguiti da un lavaggio 5 min in ciascuna delle seguenti: 95% di etanolo, 75% etanolo e dH ₂ 0. Questi lavaggi dovrebbe essere fatto in una cappa per evitare esposizione a vapori nocivi.
3. Immergere i vetrini nella vaschetta Coplin con pre-riscaldato tampone sodio citrato e poi posto in un vapore per 30 minuti, poi lasciate riposare per 30 min. Questo processo spezza le proteine ​​legami incrociati formate da fissazione in formalina recuperando potenziali siti antigenici.
4. Lavare con PBS azide per 5 min, tre volte. Vetrini asciutti e zona marchio intorno al tessuto con una penna PAP per creare una barriera idrofoba, mantenendo i reagenti di colorazione localizzati sul tessuto.
5. Tessuto blocco per 1 ora a temperatura ambiente con tampone di bloccaggio (ad esempio α-siero di capra) in una camera umida immunocolorazione.
6. Diluire primanticorpo ary alla concentrazione desiderata con tampone di diluizione anticorpo. Versare tampone bloccante ed aggiungere 50-100 ml di anticorpo primario e tessuti. Incubare a 4 ° C durante la notte oa temperatura ambiente per 2 h.
7. Lavare con PBS azide per 5 min, tre volte. Aggiungere 50-100 microlitri di anticorpo secondario diluito in tampone di diluizione anticorpo ai tessuti e incubare a temperatura ambiente per 1 h al buio. Lavare con dH ₂ O per 5 minuti, per tre volte.
8. Disidratare diapositive, aggiungere DAPI Prolong medio oro di montaggio e applicare un vetrino coprioggetti. Visualizza vetrini al microscopio a fluorescenza.

Note:

• PBS azide può essere sostituito con PBS preparata come alternativa per evitare la crescita batterica nel mezzo di lavaggio dal punto 4 in poi.

Risultati

Durante un esperimento di infezione standard, i topi sono infettati con circa 2,5 x 10 ⁸ UFC mediante sonda gastrica di 100 pl C. overnight rodentium cultura. Infezione di topi C57BL / 6 con C. rodentium risultati in perdita di peso modesto e transitorio e diarrea. Anche se un evento raro con C57BL / 6 topi, gli animali possono ammalarsi e richiedere euthanization. Pertanto, i topi devono essere monitorati per grado di perdita di peso e sintomi di disagio come pelliccia piloerect e ...

Discussione

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per lo studio di entrambi malattie infettive e colite nei topi. Questo modello unico consente la caratterizzazione di entrambe le risposte dell'ospite, come pure le proprietà di batteri patogeni. La procedura descritta in questo particolare protocollo il successo nell'uso di questo modello.

Ci sono diversi passaggi critici di questo protocollo da tenere a mente quando si induce la colite e l'analisi del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente / materiale	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Luria Broth	ABM	G247	Aggiungere 25 g di polvere di LB 1L di acqua. Autoclave prima dell'uso.
Fondo piatto quadrato con griglia	Pescatore	08-757-11A
Falcon cultura tubo	Sarstedt	62.515.006
Lampadina punta dell'ago gastrica gavage	Strumenti Scienza Belle	18060-20
1 ml siringa	BD Biosciences	309659
4 kDa FITC-destrano	Sigma	FD-4
L'acido citrico	Sigma	C7129
Citrato di sodio	Pescatore	S279-500
Destrosio	Pescatore	D16.1
Acido citrato destrosio			20 mM di acido ctiric, 110 mM di citrato di sodio, 5 mM destrosio
Nero piastra a 96 pozzetti	Pescatore	07-200-762
Perle di metallo (5 mm)	Qiagen	69989
Formalina 10%	Pescatore	5F93-4
Flaconcino da 5 ml	DiaMed	STK3205
Ematossilina	Pescatore	H345-23
Eosina	Pescatore	E511-100
Xilene	Pescatore	HC700-1GAL
Tween 20	Sigma	P5927
Coplin colorazione jar	VWR	47751-792
Sodio citrato			Citrato di sodio 10 mM, Tween 20 0,05%, pH 6,0
Pap penna	Cedarlane	Mu22
Siero di capra	Sigma	G902-3
Albumina di siero bovino (BSA)	Pescatore	BP1600-100
Triton X-100	Sigma	T8532
Sodio azide	Sigma	SZ002
Tampone di arresto			Siero di capra 2%, 1% BSA, 0,1% triton X-100, Tween 20 0,05%, 0,05% di sodioazide, 0,01 M PBS, pH 7.2, mix & conservare a 4 ° C.
Anticorpo tampone di diluizione			0,1% triton X-100, 0,1% BSA, 0,05% di sodio azide, EDTA 0,04%
Tampone di arresto e anticorpi tampone di diluizione per tir			Ricette come sopra, ma senza aggiunta di detergenti (Triton X-100 e Tween 20)
Prolungare reagente Oro Antifade con DAPI	Invitrogen	P-36.931
Coprioggetto	Pescatore	12.54SE
Agitatore da banco incubazione	Barnstead Lab Line	Max Q4000
Fluorimetro	Perkin Elmer	Victor2D
Centrifuga refrigerata	Beckman Coulter	Microcentrifuga 22R
Piroscafo	Black & Decker
Microscopio a fluorescenza	Zeiss	Axio Image.Z1